原子吸收光譜法測定血清中不同化學形態(tài)的鈷與鎳

楊會會，周志強，韓二芳，王　娟，劉　欣

（河南農業(yè)職業(yè)學院，河南鄭州　451450）

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原子吸收光譜法測定血清中不同化學形態(tài)的鈷與鎳

楊會會，周志強，韓二芳，王娟，劉欣

（河南農業(yè)職業(yè)學院，河南鄭州451450）

采用乙醇低溫（4℃）沉淀蛋白法，將血清中的鈷、鎳分為結合態(tài)和非結合態(tài)，利用石墨爐原子吸收光譜法靈敏度高、取樣量少的優(yōu)點，測定血清中的鈷、鎳2種元素的總量及非結合態(tài)含量，通過差減法求出血清中結合態(tài)元素含量，從而建立鈷、鎳2種元素化學形態(tài)的分離分析方法。以胎牛血清為例，詳細研究了儀器工作條件的優(yōu)化、沉淀劑種類及用量的選擇、測定方法準確度的考察和測定方法的精密度及檢出限。結果表明，該方法鈷、鎳的相對標準偏差分別為4.5%和2.5%，加標回收率分別為84%～98%和91%～94%，檢出限分別為6.36，8.60 μg/L，測定結果可靠。

石墨爐原子吸收；胎牛血清；鈷；鎳；化學形態(tài)

隨著醫(yī)學事業(yè)的發(fā)展及病理學研究的日益深入，微量元素與生物體健康之間關系的研究不斷有新發(fā)現(xiàn)，很多疾病都與生物體內微量元素的比例失調有關。

鈷、鎳均為生物體必需的微量元素，對生物體的細胞代謝、生物合成及生理功能起著重要的作用，并可以對內分泌功能等產生影響［1-3］。因為不同微量元素的化學形態(tài)生物效應差別很大，它們決定了元素在生物體內的化學行為，表現(xiàn)不同的效應。因此，對微量元素作用的研究，不僅要對其總量進行分析，更重要的是對微量元素存在形態(tài)進行研究。然而，目前醫(yī)學領域對機體內微量元素的研究主要集中于總量的測定，對生物體內微量元素不同的化學形態(tài)研究還很少。原子吸收光譜法雖是測定微量元素應用最廣泛的方法，但應用原子吸收光譜法測定血清中不同化學形態(tài)的鈷、鎳還未見報道。

對微量元素測定，可應用火焰原子吸收光譜法和石墨爐原子吸收光譜法。因血清中鈷、鎳含量均較低，所以本文利用石墨爐原子吸收光譜法靈敏度高、取樣量少的優(yōu)點，測定血清中的鈷、鎳含量。通過對血清中鈷、鎳2種元素不同形態(tài)測定方法的研究，建立了生物體內結合態(tài)與非結合態(tài)微量元素Co和Ni測定的方法，能為探索這些微量元素與生物體的健康關系提供更多的信息，進而為Co和Ni所導致一些疾病的治療提供幫助。

1　試驗部分

1.1試劑及儀器

濃硝酸（分析純），TritonX-100；無水乙醇（分析純），0.2%TritonX-100和硝酸混合液（取1.0 mLTritonX-100和1.0 mL硝酸，用水稀釋到500 mL容量瓶中）；Co和Ni的標準溶液（儲備液為1 g/L）；胎牛血清，鄭州佰安生物工程有限公司提供；SPDUO 240FS/240Z型原子吸收光譜儀，美國瓦里安公司產品；H2500R-2型離心機，湘儀離心機儀器有限公司產品。

1.2試驗過程

1.2.1樣品處理

（1）血清中Co和Ni總量。取-20℃環(huán)境下保存的血清樣品2.5 mL于25 mL容量瓶中，用0.2% TritonX-100和硝酸的混合液定容。

（2）血清中非結合態(tài)Co和Ni含量。取1支聚乙烯試管，加入0.8 mL胎牛血清，4.8 mL無水乙醇，2.4 mL混合溶液。靜置一夜后于轉速15 000 r/min下離心，溫度4℃，時間10 min。連續(xù)離心2次，以保證離心充分。上層清液，即制備的血清樣品中元素的非結合態(tài)樣品溶液。

1.2.2儀器工作條件

波長240.8 nm，通帶0.2 nm，燈電流10 mA，氬氣流量200 mL/min，原子化階段停氣。石墨爐Co升溫程序的為干燥（85℃，保持5 s；95℃，保持40 s；120℃，保持10 s）、灰化（963℃，5s）、原子化（2 459℃，5 s）、除殘（2 800℃，3 s），Ni的升溫程序為干燥（85℃，保持5 s；95℃，保持40 s；120℃，保持10 s）、灰化（1 021℃，5 s）、原子化（2 292℃，5 s）、除殘（2 800℃，3 s）。

2　結果與討論

2.1干燥條件優(yōu)化

移取2.5 mL胎牛血清至25 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，將其作為母液。用1%TritonX-100和硝酸混合液稀釋成0.2%的溶液作為制備液（把2種溶液分別放在自動進樣器樣品盤的相應位置，分析時自動進樣裝置會將上述2種溶液按一定比例混合，組成與樣品基體的黏度、表面張力大致相同的溶液，以便較準確考察干燥時的情況。），然后在儀器軟件的引導下（第1步，85℃，5 s；第2步，95℃，40 s；第3步，120℃，10 s）進行干燥。通過石墨爐視頻畫面觀察干燥的效果，發(fā)現(xiàn)在給定的干燥溫度及時間下，溶劑可以完全蒸發(fā)，灰化時無液體飛濺現(xiàn)象，所以儀器軟件引導下的干燥步驟、溫度和時間是合適的。

2.2灰化和原子化溫度及時間

取適量Co和Ni的標準溶液，逐級稀釋至質量濃度為20 μg/L，作為母液。移取20 mL混液至100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋定容，作為制備液。利用儀器的表面響應動力學向導可得到Co2+和Ni2+灰化和原子化溫度及時間的優(yōu)化程序，在該程序下儀器自動測定工作，并給出測定結果和優(yōu)化圖。

Co2+灰化和原子化溫度及時間的優(yōu)化結果見圖1，Ni2+灰化和原子化溫度及時間的優(yōu)化結果見圖2。

圖1　C o2+灰化和原子化溫度及時間的優(yōu)化結果

圖2　N i2+灰化和原子化溫度及時間的優(yōu)化結果

根據(jù)圖1，儀器自動給出Co的最佳工作條件為灰化溫度963℃，原子化溫度2 459℃。根據(jù)圖2，Ni的最佳工作條件為灰化溫度1 021℃，原子化溫度2 292℃。

2.3沉淀劑的選擇

結合態(tài)與非結合態(tài)測定結果的準確度在一定程度上取決于蛋白質的分離狀況，選擇合適的沉淀劑是非常重要的。目前，蛋白質的沉淀主要有鹽析法、有機溶劑沉淀法、重金屬鹽析法、生物堿試劑和某些酸沉淀法以及加熱變性沉淀法等。

血清中Co的存在形式主要有與生物大分子結合的生物金屬和自由離子，即結合態(tài)與非結合態(tài)。使用蛋白沉淀劑把血清中的蛋白沉淀，結合態(tài)的微量元素隨蛋白質進入沉淀中，上清液中剩下的元素即為非結合態(tài)。如果采用鹽析法、重金屬鹽析法、生物堿試劑和某些酸沉淀法、加熱變性沉淀法，都會向樣品中引入其他元素，從而給測定帶來不可預知的影響。所以，本試驗選用有機溶劑沉淀法，因甲醇與丙酮毒性均比乙醇大，故而乙醇是較為理想的沉淀劑。同時，由文獻［4］可知乙醇低溫沉淀蛋白法不僅完全且溫和，對結合態(tài)的元素影響較小，且取材容易、操作簡單、成本低廉、耗時短、可重復性好。因而，本試驗選用乙醇作為沉淀劑。

2.4沉淀劑用量的選擇

取4支具塞聚乙烯試管，編號為1，2，3，4，分別加入0.80 mL血清樣品，依次加入乙醇4.00，4.40，4.80，5.20 mL，加水定容至8.00 mL，使乙醇體積分數(shù)一次達到50%，55%，60%，65%，血清濃度均為10%。

靜置一夜后，用湘儀離心機進行離心，條件為轉速15 000 r/min，溫度4℃，時間10 min，連續(xù)離心2次，以保證離心充分。取上層清液，用石墨爐在優(yōu)化條件下測定Co和Ni的含量。因乙醇中本身含有少量的Co和Ni，需測定空白乙醇中2種元素的含量。

胎牛血清中Co和Ni的含量見表1。

表1　胎牛血清中C o和N i的含量/μg·L-1

由表1可知，對于Co而言，乙醇體積分數(shù)為60%時，分離結合態(tài)與非結合態(tài)的效果最好。因而，本試驗采用60%乙醇為沉淀劑分離血清，測定非結合態(tài)中Co的含量。對于Ni而言，測定結果均為負值，分析發(fā)現(xiàn)原因主要為無水乙醇中Ni含量太高，經蒸餾后仍無法消除，使背景吸收較大，而胎牛血清中Ni含量本就較低，致使元素Ni的測定不準確。

2.5工作曲線

分別配制Co和Ni的標準溶液，使其質量濃度分別達到0，3.00，6.00，9.00，15.00 μg/L，測定其吸光度，繪制標準曲線。對空白樣品低質量濃度加標試驗，按照樣品處理方法平行分析7份空白加標樣品，根據(jù)標準偏差計算Co和Ni的方法檢出限。

Co和Ni的標準曲線與方法檢出限見表2。

表2　C o和N i的標準曲線與方法檢出限

2.6方法的加標回收率和精密度

Co和Ni的回收率及相對標準偏差見表3。

在空白樣品中，加Co和Ni標準溶液，按照樣品處理方法處理后用原子吸收進行測定。平行測定7次，得到Co和Ni的回收率及樣品結果的相對標準偏差。方法回收率和精密度滿足樣品分析要求。

表3　C o和N i的回收率及相對標準偏差

2.7胎牛血清中Co和Ni含量測定

按照試驗優(yōu)化過的樣品前處理和測定參數(shù)對樣品進行測定，胎牛血清中結合態(tài)Co的含量=血清中Co的總含量-非結合態(tài)Co的含量。

血清中不同形態(tài)Co和Ni的測定結果見表4。

表4　血清中不同形態(tài)C o和N i的測定結果/μg·L-1

3　結論

本試驗通過配制合適質量濃度的母液，利用石墨爐的表面響應動力學向導，優(yōu)化Co和Ni的工作條件；選用乙醇作為沉淀劑，通過測定不同體積分數(shù)乙醇下血清分離情況，得出乙醇體積分數(shù)為60%時分離效果最好。在優(yōu)化條件下，測定血清中Co和Ni含量及非結合態(tài)10%血清中元素含量，通過差減法求出結合態(tài)元素含量。結果表明，Co的RSD為4.5%，回收率在84%～98%；Ni的RSD為2.5%，回收率91%～94%，方法可靠，結果較為可信，為探索這些微量元素與生物體的健康關系提供更多的信息，進而為Co和Ni所導致一些疾病的治療提供幫助。

［1］汪紅梅.過敏性鼻炎患者血清中鉻鈷鎳釩鉬含量的研究 ［J］.內蒙古醫(yī)學雜志，2008，40（1）：102-103.

［2］苗懿德，劉杰，劉曉瑞.健康老年人與糖尿病患者血清10種元素測定比較 ［J］.微量元素與健康研究，2001，18（3）：23-24.

［3］劉巨濤，朱志國，年瑞華，等.中老年糖尿病輕重度患者血清中的鐵鉻鈷鎳 ［J］.光譜學與光譜分析，2000，20（1）：87-88.

［4］胡軍，常耀明，高雙斌.原子吸收光譜法測定血清中不同化學形態(tài)的銅鐵鋅 ［J］.光譜學與光譜分析，2008，28（3）：700-703.◇

Determination of Different Chemical Form of Co and Ni in Fetal Bovine Serum by Atomic Absorption Spectrometry

YANG Huihui，ZHOU Zhiqiang，HAN Erfang，WANG Juan，LIU Xin
（He'nan Vocational College of Agriculture，Zhengzhou，He'nan 451450，China）

Separate cobalt and nickel in the serum into the forms of combination and non-combination by the use of ethanol at low temperature（4℃） protein precipitation method.Because the sensitivity of GFAAS is high and the sampling is low，this study uses it to analysis the total amount of Co and Ni in serum and the amount of the forms of non-combination.The amount of the forms of combination of Co and Ni is obtained by calculation，so as to establish two chemical forms of Co and Ni separation element analysis method.Take fetal bovine serum for example，a detailed study are as follow：working conditions for the choice of instruments，the type and amount of precipitation agent of choice，determination of the accuracy of the inspection，determination of precision and seizure the limited.The results show that the cobalt and nickel，respectively，the relative standard deviation of 4.5%and 2.5%，and recovery are 84%～98%and 91%～94%，respectively，the detection limit 6.36，8.60 μg/L.The result is accurate and reliable.

GFAAS；fetal bovine serum；cobalt；nickel；chemical form

P618.63

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.07.018

1671-9646（2016）07a-0059-03

2016-04-12

楊會會（1987— ），女，碩士，助教，研究方向為食品與環(huán)境分析。