陳楠，高雯，張磊，董羅濤，沈澤恩，魏文志，付立霞（江蘇省人畜共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇　揚(yáng)州　225009）

水溫、pH值和光照對(duì)斑馬魚受精卵孵化率的影響

陳楠，高雯，張磊，董羅濤，沈澤恩，魏文志，付立霞
（江蘇省人畜共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

摘要：分別通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)探究水溫、pH值和光照對(duì)斑馬魚受精卵孵化率的影響。依次進(jìn)行的單因素實(shí)驗(yàn)顯示，水溫28℃，pH值7.5，光照強(qiáng)度100 lx，光周期10L∶14D時(shí)孵化率最高。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上述因素對(duì)斑馬魚受精卵孵化率的影響為:水溫＞pH＝光照強(qiáng)度＞光照周期，理論最佳孵化條件為水溫28℃，pH值8.0，光照強(qiáng)度100l x，光周期12L∶12D。在孵化過程中，受精卵孵化時(shí)間隨著孵化溫度的提高而縮短，且在發(fā)育過程中存在不同步現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：斑馬魚；孵化率；水溫；pH值；光照

斑馬魚，又稱藍(lán)條魚、花條魚和斑馬擔(dān)尼魚，隸屬于鯉科（Cyprinidae），短擔(dān)尼魚屬（Brachydanio），是原產(chǎn)于南亞的一種亞熱帶小型淡水觀賞魚類。由于易飼養(yǎng)，個(gè)體?。ǔ婶~體長(zhǎng)僅為3～5 cm），繁殖快（從受精卵到性成熟只需3個(gè)月左右），可周期產(chǎn)卵（產(chǎn)卵周期約10 d左右），而且早期胚胎完全透明，便于觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，這使得斑馬魚成為生物學(xué)研究的最佳脊椎動(dòng)物模型。隨著斑馬魚基因組測(cè)序工作的完成與發(fā)布，斑馬魚的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，目前斑馬魚已被廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、藥物學(xué)、毒理與環(huán)保等諸多方面的研究［1-2］。

持續(xù)穩(wěn)定的斑馬魚胚胎及苗種供應(yīng)是開展相關(guān)研究的重要保障。為避免市售斑馬魚質(zhì)量的良莠不齊，一些實(shí)驗(yàn)室建立了斑馬魚繁育、養(yǎng)殖系統(tǒng)以保證研究的順利進(jìn)行。孵化是斑馬魚人工繁育的重要環(huán)節(jié)，在一定程度上決定著后續(xù)工作的成敗，不過當(dāng)前關(guān)于斑馬魚孵化的相關(guān)資料僅限于技術(shù)性描述，缺乏系統(tǒng)性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［3-4］。鑒于此，本研究擬從水溫、pH值及光照等方面對(duì)斑馬魚受精卵的孵化率進(jìn)行比較研究，探索斑馬魚受精卵孵化的最佳條件，提高其孵化效益，加速其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用研究。

1　材料和方法

1.1斑馬魚

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚購(gòu)自南京夫子廟水族市場(chǎng)，日常飼養(yǎng)于室內(nèi)水族箱內(nèi)，水溫控制于28℃，投喂商用配合飼料，每天2次，分別為9：00及16：00，投飼量以斑馬魚在10 min內(nèi)吃完為好。每1～2 d吸污一次，并更換部分養(yǎng)殖用水，定時(shí)用增氧泵進(jìn)行增氧。繁殖前半月，將雌、雄親魚進(jìn)行分開飼養(yǎng)，并投喂活性飼料進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，活性飼料包括去殼鹵蟲卵、草履蟲及室外撈取并經(jīng)聚維酮碘浸泡消毒清洗后的紅蟲等。

1.2受精卵

實(shí)驗(yàn)用受精卵通過斑馬魚的人工繁殖獲得。具體操作為：先將充分曝氣的自來水注入經(jīng)消毒的水族缸中，然后放入小型繁殖網(wǎng)箱（44 cm×24 cm×30 cm），網(wǎng)箱網(wǎng)孔直徑約2 mm，通過側(cè)邊吸盤吸附于水族缸壁，保持箱體底部離缸底10 cm左右以防止親魚產(chǎn)卵后吞噬魚卵。于傍晚時(shí)分將親魚放入布置好的繁殖箱中，雌雄比例2∶3，向繁殖缸中補(bǔ)充部分曝氣自來水以刺激親魚發(fā)情產(chǎn)卵。待親魚產(chǎn)卵后將其移出繁殖缸，用管口平滑圓潤(rùn)大口吸管從缸底緩慢吸取質(zhì)量良好的受精卵用于下一階段的實(shí)驗(yàn)。

1.3單因素實(shí)驗(yàn)

為獲得各因素的最佳取值范圍，首先進(jìn)行單因素孵化實(shí)驗(yàn)，每個(gè)因素水平設(shè)2個(gè)重復(fù)，隨機(jī)選取30粒受精卵于1 000 mL燒杯內(nèi)進(jìn)行人工孵化。為防止缺氧造成受精卵死亡，用吸管將受精卵輕輕吹散，使其均勻分布于燒杯底部，并不時(shí)利用吸管補(bǔ)充氧氣。在孵化過程中密切觀察受精卵的變化情況，及時(shí)挑出死卵，防止水霉的發(fā)生。

孵化水溫分別設(shè)置為24、26、28、30℃；pH值分別為6.5、7、7.5、8、8.5；光照強(qiáng)度分別為50、100、200、300、400 lx；光周期分別為8L∶16D（阿拉伯?dāng)?shù)為小時(shí)數(shù)，L為光照，D為黑暗避光，后同）、10L∶14D、12L∶12D、14L∶10D，實(shí)驗(yàn)期間當(dāng)某個(gè)組的光照時(shí)間結(jié)束后，立即將其移入遮光區(qū)域，其他組則繼續(xù)正常接受光照。

1.4正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原理，以受精卵孵化率為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，設(shè)置水溫、pH、光照強(qiáng)度和光照周期4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平，進(jìn)行4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)，具體因素水平見表1。實(shí)驗(yàn)期間密切觀察受精卵胚胎的發(fā)育情況，并進(jìn)行相應(yīng)記錄，胚胎的發(fā)育分期參照Kimmel等的描述［5］。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

按照下列公式計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組孵化率：

孵化率=出膜苗數(shù)/孵化卵數(shù)×100%對(duì)正交實(shí)驗(yàn)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1　正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

2　結(jié)果

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

在設(shè)定的水溫范圍內(nèi)，斑馬魚受精卵的孵化率為55%～85%，其中水溫24℃時(shí)孵化率最低，為55%。隨著水溫的升高，孵化率亦開始增加，并于28℃時(shí)達(dá)到峰值85%，隨后孵化率又逐漸下降，30℃水溫時(shí)孵化率為75%。不同pH條件下斑馬魚受精卵的孵化率亦有較大差異，當(dāng)pH在6.5～7.5之間時(shí)，孵化率為81.7%～90%，呈上升趨勢(shì)。但當(dāng)pH超過7.5時(shí)，孵化率則突然大幅下降，pH 8.0和8.5時(shí)的孵化率分別為75%和76.7%（圖1）。

圖1　不同水溫（■）和pH（●）下受精卵孵化

在設(shè)定的光照強(qiáng)度范圍內(nèi)，50 lx時(shí)孵化率為88.3%，100 lx時(shí)孵化率達(dá)到最高，為91.7%。之后隨著光照強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，孵化率呈下降趨勢(shì)，400 lx時(shí)孵化率最低，為76.7%。在所設(shè)定的四組不同光周期中，10 h光照組（10L∶14D）孵化率最高，為71.7%；相較之下，14 h光照組（14L∶10D）孵化率最低，僅為45%（圖2）。

2.2正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)L9（34）正交設(shè)計(jì)表，一共開展9個(gè)組合的實(shí)驗(yàn)，具體結(jié)果見表2，其中A2B1C2D3組合孵化率最高，為85%。后續(xù)進(jìn)行的極差分析顯示RA＞RB=RC＞RD，即四因素對(duì)斑馬魚受精卵孵化率的作用由大到小依次為：水溫，光照強(qiáng)度，pH，光照周期。根據(jù)K值推斷最佳孵化條件為A2B3C2D3，即水溫為28℃、pH 為8、光照強(qiáng)度為100 lx、光周期為12L∶12D時(shí)，斑馬魚受精卵的孵化率最高（表3）。

2.3斑馬魚的胚胎發(fā)育

圖2　不同光照強(qiáng)度（◆）和光周期（▌）下受精卵孵化率

實(shí)驗(yàn)中受精卵孵化時(shí)間隨著孵化溫度的提高而縮短，且在發(fā)育過程中存在不同步現(xiàn)象。在28℃水溫條件下，從受精到出膜約需3 d左右時(shí)間，歷經(jīng)受精卵期，卵裂期、囊胚期、原腸胚期、體節(jié)期、咽部期和孵化期7個(gè)主要階段，每一階段歷時(shí)各不相同，其中受精卵期發(fā)生于0～0.75 h，卵裂期為0.75～2.5 h，囊胚期為2.5～6.0 h，原腸胚期為6～18 h，體節(jié)期為18～32 h，咽部期為32～46 h，孵化期為46～70 h。

3　討論

魚類受精卵的孵化涉及一系列復(fù)雜的生理、生化過程，會(huì)受到諸多因素的影響。水溫和pH值可直接影響各種孵化相關(guān)酶類的活性，進(jìn)而對(duì)孵化進(jìn)程產(chǎn)生作用［6-7］。孵化與接收光照的時(shí)間、強(qiáng)度也有密切的關(guān)系，這是因?yàn)槌渥愕墓庹詹坏欣谒疁氐奶岣?，更重要的是可以消毒殺菌，使受精卵在孵化期間免遭水霉的侵害，而且光周期的變化可以直接啟動(dòng)生物的節(jié)律［8-9］。

表2　正交實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果

表3　極差分析表

通常，不同魚類適宜的孵化條件各不相同，即使同一種魚，在不同的環(huán)境條件中生存較長(zhǎng)時(shí)間后，其適宜的生長(zhǎng)、發(fā)育條件也會(huì)發(fā)生改變［10］。就斑馬魚而言，董武等［4］認(rèn)為適宜的胚胎發(fā)育溫度為25～31℃，袁宗勤等［10］通過觀察比較斑馬魚受精卵在不同溫度條件下的病死率、孵化率等指標(biāo)后，推斷28℃為最佳孵化溫度，與本研究結(jié)果一致。

目前尚無關(guān)于pH值、光照等對(duì)斑馬魚受精卵孵化率影響的研究報(bào)道，但在相關(guān)文獻(xiàn)中一般建議飼養(yǎng)斑馬魚時(shí)保持pH為7.0～8.0，光照強(qiáng)度為54～324 lx，光照期為14L∶10D［11-12］。本研究中，無論是單因素實(shí)驗(yàn)還是正交實(shí)驗(yàn)，適宜pH值和光照強(qiáng)度均在建議范圍之內(nèi)，但適宜的光周期卻有所不同。單因素實(shí)驗(yàn)中光周期為10L∶14D時(shí)孵化率最高，正交實(shí)驗(yàn)中最佳孵化光周期則為12L∶12D，這可能與魚類的受精卵孵化不宜長(zhǎng)時(shí)間光照有關(guān)，類似現(xiàn)象在大銀魚卵的孵化中也曾有過報(bào)道［13］。

本次研究中另一個(gè)值得注意的現(xiàn)象就是單因素實(shí)驗(yàn)所得出的最佳孵化條件與通過正交實(shí)驗(yàn)推斷的最佳孵化條件并不完全一致，除上述光周期之外，pH值也不相同，單因素實(shí)驗(yàn)中pH值為7.5時(shí)孵化率最高，但在正交實(shí)驗(yàn)中，pH值為8時(shí)孵化率最高，這可能是由于其他因素互作效應(yīng)的影響。相較于單因素實(shí)驗(yàn)每次只能關(guān)注于一個(gè)因素，正交實(shí)驗(yàn)更適合于多因素多水平實(shí)驗(yàn)條件的研究，只需選擇適當(dāng)?shù)恼槐韥戆才艑?shí)驗(yàn)，即可找到諸多因素中對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)有顯著影響的主要因素，并確定使實(shí)驗(yàn)指標(biāo)達(dá)到最佳的因素水平，而且相關(guān)結(jié)論具有更好的重復(fù)性［14］。目前，正交實(shí)驗(yàn)已廣泛應(yīng)用于許多領(lǐng)域生產(chǎn)工藝或條件的優(yōu)化［15］，不過在魚類受精卵孵化條件的優(yōu)化方面尚鮮有報(bào)道。此外，在孵化過程中，斑馬魚的胚胎發(fā)育存在不同步現(xiàn)象，且每一階段經(jīng)歷的時(shí)間與Kimmel等的研究報(bào)道不完全一致，這可能與孵化條件不同有關(guān)。

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資助項(xiàng)目：江蘇省人畜共患病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（R1510）；揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（x2015680）

中圖分類號(hào)：Q173

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2091（2016）07-0027-5

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.07.006

收稿日期：（2016-02-22）

作者簡(jiǎn)介：陳楠（1993-），女，學(xué)士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)；

通訊作者：付立霞，男，博士，E-mail:dynamicren@163.com

Effects of water temperature，pH and light on the hatching rate of zebrafish oosperm

Chen Nan，Gao Wen，Zhang Lei，Dong Luotao，Shen Zeen，Wei Wenzhi，F(xiàn)u Lixia
（Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis，College of Animal Science，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：The effects of water temperature，pH and light intensity and period on the hatching rate of ze－brafish oosperm were explored by single factor experiments and orthogonal test.The optimum value for the four factors，deduced from the results of single factor experiments，were 28℃，7.5，100 lx and 10L∶14D，respectively，for the hatching rate in the condition of one of them was highest among their groups.However，the results of orthogonal test indicated that the best hatching condition could be the combination of 28℃，8，100 lx and 10L: 14D，and the influence order of individual factor was:water temperature＞pH＝light intensity＞light period.In the process of incubation，the hatching time became shorter with the increase of water temperature and asynchrony was observed in the development of zebrafish.

Key words：zebrafish；hatching rate；water temperature；pH；light