耐甲氧西林金黃色葡萄球菌外排系統(tǒng)抑制劑的中藥篩選

安尉，王迪，謝鯤鵬，謝明杰

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連 116081)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌外排系統(tǒng)抑制劑的中藥篩選

安尉?，王迪?，謝鯤鵬，謝明杰Δ

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點實驗室，遼寧 大連 116081)

目的從中藥中篩選耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus，MRSA)外排系統(tǒng)的抑制劑。方法采用頭孢西丁紙片法和PCR法鑒定供試菌株的耐藥性及其外排基因norA與qacA/B；采用平板打孔法測定中藥對MRSA41577的抑菌作用；采用聯(lián)合藥敏試驗和雙平板法測定中藥對MRSA41577外排系統(tǒng)的抑制作用。結(jié)果MRSA41577為耐藥菌株，菌株內(nèi)含有norA及qacA/B外排基因；24種中藥粗提物中有22種對MRSA41577有抑制作用，只有水飛薊和穿心蓮對MRSA41577無抑制作用；聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果顯示，水飛薊和穿心蓮分別與MRSA41577的耐藥底物環(huán)丙沙星和苯扎氯銨聯(lián)合作用后，均能恢復(fù)細菌對2種藥物的敏感性，其中32 mg/mL的水飛薊和穿心蓮分別與環(huán)丙沙星和苯扎氯銨聯(lián)用后，能使環(huán)丙沙星抑制MRSA41577的MIC由128 μg/mL均降低至4 μg/mL以下，苯扎氯銨抑制MRSA41577的MIC由4 μg/mL分別降低至0.5 μg/mL和1 μg/mL；雙平板結(jié)果顯示，在含有終濃度為32 μg/mL的環(huán)丙沙星和2 μg/mL的苯扎氯銨平板中，加入水飛薊和穿心蓮后，能恢復(fù)環(huán)丙沙星和苯扎氯銨對MRSA41577的抑制作用。結(jié)論水飛薊和穿心蓮是MRSA41577的外排系統(tǒng)抑制劑。

中藥；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；外排系統(tǒng)；抑制劑

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus,MRSA)的感染幾乎遍及全球，已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一，與艾滋病、乙肝共同成為世界三大最難解決的感染性疾病[1-2]。MRSA除了對甲氧西林耐藥外，對β-內(nèi)酰胺類、頭孢類、氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類等類型抗生素也產(chǎn)生不同程度的耐藥，為多重耐藥菌[3]。研究表明,主動外排系統(tǒng)是細菌產(chǎn)生多重耐藥性的主要原因[4]。目前已知一些能夠抑制細菌外排系統(tǒng)的抑制劑，如利血平和奧美拉唑等，但這些藥物都具有一定的毒性，因此篩選得到高效低毒的外排系統(tǒng)抑制劑是解決細菌耐藥性的有效途徑[5-6]。中國中草藥資源十分豐富，具有低毒或無毒、作用靶位多，不易產(chǎn)生耐藥性等特點[7]，因此中藥是獲得MRSA外排泵抑制劑的重要來源之一。本文擬從24種中藥粗提物中通過平板打孔法、聯(lián)合藥敏法和雙平板法篩選對MRSA41577外排系統(tǒng)具有抑制作用的藥物，旨在為中藥開發(fā)外排系統(tǒng)的抑制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌：MRSA41577細菌株由大連市中心醫(yī)院提供。質(zhì)控菌株S.aureus ATCC25923購自中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

1.1.2 試劑：中藥粗提物由遼寧師范大學(xué)中藥現(xiàn)代化實驗室提供；頭孢西丁紙片和利血平標(biāo)準品購于大連諾威信生物技術(shù)有限公司；氯代三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)和環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)購于上海生工生物有限公司；苯扎氯銨(benzalkonium chloride，BEN)由大連三星化學(xué)公司提供；引物及PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中藥粗提物制備方法：稱取一定量的待測中草藥，用索氏提取器以95%的乙醇熱回流提取8 h后將提取液濃縮制成干粉。精確稱取一定量的干粉，將其用無水乙醇配制成一定濃度的母液，0.22 μm濾器過濾后備用。

1.2.2 菌株耐藥性的檢測[8]：采用頭孢西丁紙片法鑒定MRSA41577的耐藥性。PCR擴增法檢測2種外排基因norA和qacA/B。

1.2.3 24種中藥粗提物對MRSA41577的抑制作用：采用平板打孔法測定[9]：首先制備LB底層固體培養(yǎng)基平板，將含有150 μL濃度為107cfu/mL的MRSA41577菌懸液和5 mL的LB半固體培養(yǎng)基到上層，待凝固后用直徑6 mm打孔器打孔并取出孔內(nèi)瓊脂塊，然后用1滴固體培養(yǎng)基封底，以防藥液外溢。最后在孔內(nèi)分別加入200 μL的20種中藥粗提物，37 ℃下培養(yǎng)24 h。以等體積的無水乙醇為對照組。待培養(yǎng)結(jié)束后用卡尺測量抑菌圈直徑，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 聯(lián)合藥敏試驗測定中藥對MRSA41577外排系統(tǒng)的抑制作用：采用TTC法測定[10]:于96孔板中分別加入100 μL濃度為105cfu/mL的MRSA41577菌懸液，再加入10 μL待測定的中藥粗提物、環(huán)丙沙星和苯扎氯銨，使待測中藥粗提物的終濃度分別為0.25～32 mg/mL，環(huán)丙沙星的終濃度為4～256 μg/mL，苯扎氯銨的終濃度為0.5～8 μg/mL。37 ℃下120 r/min恒溫培養(yǎng)24 h。待培養(yǎng)結(jié)束后分別加入20 μL 0.2%的TTC，37 ℃下避光培養(yǎng)4h后觀察培養(yǎng)基顏色的變化，以不加藥物的孔為空白對照，以外排泵抑制劑利血平為陽性對照。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 雙平板法[11]測定中藥對MRSA41577主動外排系統(tǒng)的抑制作用：制備雙層平板：底層平板為20 mL的LB固體培養(yǎng)基，上層平板分別為200 μL濃度為107cfu/mL的MRSA41577菌懸液、5 mL的LB半固體培養(yǎng)基和終濃度分別為32 μg/mL的環(huán)丙沙星和2 μg/mL的苯扎氯銨。待培養(yǎng)基凝固后，用干凈的打孔器在平板上均勻打孔，并用一滴固體培養(yǎng)基封底。在孔中分別加入80 μg的陽性對照利血平和10 mg的水飛薊和穿心蓮，恒溫培養(yǎng)24 h后觀察并記錄結(jié)果。以上層平板中不加環(huán)丙沙星和苯扎氯銨為空白對照，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MRSA41577的鑒定結(jié)果 頭孢西丁紙片法結(jié)果顯示，MRSA41577菌株為耐藥菌株。PCR結(jié)果顯示MRSA41577中含有norA及qacA/B 2種外排基因，推測MRSA41577的耐藥性與norA和qacA/B外排基因的存在有關(guān)。

2.2 24種中藥對MRSA41577抑制作用 實驗結(jié)果顯示，24種中藥粗提物中有22種對MRSA41577具有不同程度的抑制作用，只有水飛薊(SM)和穿心蓮(AP)對MRSA41577無抑制作用。見表1。

表1 24種中藥對MRSA41577的抑菌作用Tab.1 The antibacterial effect of 24 kinds of Chinese crude extract on MRSA41577

具有抑菌活性和無抑菌活性的中藥都可能是細菌外排泵抑制劑，本實驗考慮到有抑菌活性的中藥粗提物會對后續(xù)的聯(lián)合藥敏實驗結(jié)果存在干擾，因此本文只對無抑菌活性的水飛薊和穿心蓮對MRSA41577外排系統(tǒng)的抑制作用進行研究。

2.3 聯(lián)合藥敏試驗檢測水飛薊和穿心蓮對MRSA41577外排系統(tǒng)的抑制作用 實驗結(jié)果顯示，水飛薊和穿心蓮在濃度2～64 mg/mL范圍內(nèi)對MRSA41577均無抑制作用，但水飛薊和穿心蓮分別與環(huán)丙沙星和苯扎氯銨聯(lián)用后，可以降低環(huán)丙沙星和苯扎氯銨抑制MRSA41577的MIC。其中32 mg/mL的水飛薊和穿心蓮能使環(huán)丙沙星抑制MRSA41577的MIC均由128 μg/mL降低至4 μg/mL以下。見表2。32 mg/mL的水飛薊和穿心蓮能使苯扎氯銨的MIC由4 μg/mL分別降低至0.5 μg /mL和1 μg /mL。見表3。

表2 水飛薊和穿心蓮與環(huán)丙沙星的協(xié)同作用

“+”，有菌生長，bacteria growth；“-”，無菌生長，no-bacterial growth

表3 水飛薊和穿心蓮與苯扎氯銨的協(xié)同作用Tab.3 The synergistic effect of BEN combination with SM and AP

“+”，有菌生長，bacteria growth；“-”，無菌生長，no-bacterial growth

以上結(jié)果表明水飛薊與穿心蓮均能恢復(fù)MRSA41577對環(huán)丙沙星和苯扎氯銨的敏感性，由此推測水飛薊和穿心蓮能夠抑制MRSA41577的外排系統(tǒng)。

2.4 雙平板法檢測水飛薊和穿心蓮對MRSA41577外排系統(tǒng)的抑制作用 實驗結(jié)果顯示，水飛薊和穿心蓮在不含環(huán)丙沙星和苯扎氯銨的平板中不能形成抑菌圈，但在含有終濃度為32 μg/mL的環(huán)丙沙星和2 μg/mL的苯扎氯銨平板中，則能恢復(fù)環(huán)丙沙星和苯扎氯銨對MRSA41577的抑制作用，抑菌圈直徑均在12 mm以上，其中水飛薊的作用效果與利血平接近。表明水飛薊和穿心蓮是MRSA41577良好的外排泵抑制劑。見表4。

表4 水飛薊和穿心蓮對MRSA41577主動外排系統(tǒng)的作用Tab.4 The effect of SM and AP on MRSA41577 efflux system

3 討論

通過篩選和研發(fā)外排泵抑制劑阻止外排泵對藥物及毒物的外排作用，已成為恢復(fù)細菌對抗生素敏感性的重要手段[12-13]。研究顯示，許多中藥是細菌的外排泵抑制劑[14-15]。能顯著降低耐藥菌的MIC是主動外排系統(tǒng)的存在的標(biāo)志，本文的聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果顯示，水飛薊和穿心蓮分別與MRSA41577的耐藥底物環(huán)丙沙星和苯扎氯銨聯(lián)合作用后，均能恢復(fù)細菌對2種藥物的敏感性，其中32 mg/mL的水飛薊和穿心蓮與環(huán)丙沙星聯(lián)用后，能使環(huán)丙沙星抑制MRSA41577的MIC降低32倍以上，苯扎氯銨的MIC降低4倍以上。雙平板實驗結(jié)果與聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果一致，其中水飛薊抑制MRSA41577外排系統(tǒng)的抑制作用優(yōu)于穿心蓮。關(guān)于2者抑制MRSA41577外排系統(tǒng)的作用機制有待于進一步的研究。

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(編校：苗加會)

Screeningofmethicillin-resistantstaphylococcusaureuseffluxsysteminhibitorsfromtraditionalChinesemedicine

AN Wei?, WANG Di?, XIE Kun-peng, XIE Ming-jieΔ
(School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Key Laboratory of Biotechnology and Drug Discovery of Liaoning Province, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo screen MRSA efflux system inhibitors from traditional Chinese medicine.MethodsCefoxitin paper method and PCR method using resistance for the identification of strains and efflux gene of norA and qacA/B.Traditional Chinese medicine was evaluated by plate punching method for MRSA41577 bacteriostatic action.The inhibition of MRSA41577 efflux system was determined by combined chemosensitivity test and double-plate method.ResultsMRSA 41577 is a drug resistant strain, whith contained the efflux genes norA and qacA/B.22 of 24 traditional chinese medicine showed inhibitory action to MRSA41577, only silymarin and AndrogrAphis paniculata have no inhibitory effect on MRSA41577.The results of combined chemosensitivity test showed that silymarin and Andrographis paniculata combinated with drug-resistant substrates of MRSA41577 Ciprofloxacin and benzalkonium chloride respectively,can restore the sensitivity of bacteria to the two drugs.Silymarin and andrographis paniculata at 32 mg/mL combined with ciprofloxacin and benzalkonium chloride respectively reduced the MIC of ciprofloxacin to MRSA41577 from 128 μg/mL to 4 μg/mL,the MIC of benzalkonium chloride decreased from 4 μg/mL to 0.5 μg/mL and 1 μg/mL respectively.The results of the double-plate assay showed that, in the plate with ciprofloxacin at 32 μg/mL of final concentration and benzalkonium chloride at 2 μg/mL, the inhibitory effect of ciprofloxacin and benzalkonium chloride on MRSA41577 was restored when silymarin and andrographis paniculata were added.ConclusionSilymarin and andrographis paniculata are efflux system inhibitors of MRSA41577.

traditional chinese medicine;methicillinresistantstaphylococcusaureus; efflux system; inhibitors

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.10.006

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項目(L201683675)；遼寧省自然科學(xué)基金項目(201602462)

安尉，女，本科，研究方向：生物科學(xué)，E-mail：836315071@qq.com；王迪，共同第一作者，女 ，碩士在讀，研究方向：微生物生化，E-mail：momoxiaodi@sina.com；謝明杰，通信作者，女，博士，教授，研究方向：微生物生化，E-mail：xmj1222@sina.com。

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