熊瑛，董煜，楊祖菁，古航

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海200092；2上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院)

?

先天性膈疝相關(guān)基因的篩選

熊瑛1，董煜1，楊祖菁1，古航2

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海200092；2上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院)

目的篩選先天性膈疝的相關(guān)基因。方法確診為先天性膈疝的11例胎兒，出生后使用Affymetrix Cytoscan 750K平臺微陣列進(jìn)行分析。結(jié)果僅1例患兒檢出基因序列異常，包括268-kb的重復(fù)2q33.1、ARR [hg19] 2q33.1(201,303,201-201,571,143)，一個純合性缺失的8p11.22、ARR [hg19] 8p11.22(39,226,335-39,388,919)，以及12p13.33的部分損失、ARR [hg19] 12p13.33(1,262,947-1,375,084)。檢出5個基因發(fā)生序列重復(fù)，包括SPATS2L、KCTD18、Shugoshin樣蛋白2(SGOL2)、醛氧化酶1(AOX1)、AOX2P；2個基因發(fā)生純合缺失，為ADAM5、ADAM3A；1個基因為ERC1發(fā)生了雜合性的部分損失。該患兒母親為初產(chǎn)婦，合并妊娠期糖尿病，進(jìn)行微陣列分析未檢出基因序列異常。結(jié)論篩選出先天性膈疝患兒8個基因發(fā)生序列異常，包括SPATS2L、KCTD18、Shugoshin樣蛋白2、醛氧化酶1、醛氧化酶2P、ADAM5、ADAM3A和ERC1。這些基因序列異?？赡苁窍忍煨噪躔薜臐撛诟蛩?。

膈疝；先天性膈疝；全基因組芯片技術(shù)；SPATS2L；KCTD18；Shugoshin樣蛋白2；醛氧化酶1；醛氧化酶2P；ADAM；ERC1

先天性膈疝(CDH)是一種可危及新生兒生命的先天性畸形，病死率高[1]。美國學(xué)者[2]報道CDH的發(fā)病率為1.93/10 000胎。CDH可分為三種類型：后外側(cè)膈疝(最常見)、前部型膈疝和中央橫膈疝(最少見)[3]?；純旱脑心冈趹言衅陂g大多已經(jīng)明確診斷，并存在分離型的缺陷或非分離型的缺陷，也可能同時有其他類型的胎兒異常。CDH的病因仍然不明。遺傳因素在CDH發(fā)病中的作用漸漸得到明確[4]。Lan等[5]研究認(rèn)為新發(fā)的拷貝數(shù)變異與CDH相關(guān)，并證實KCNA2、LMNA、CACNA1S、MYOG、HLX、LBR、AGT、GATA4、SOX7、HYLS1、FOXC1、FOXF2、PDGFA、FGF6、COL4A1、COL4A2、HOMER2、BNC1、BID和TBX1等基因可能參與膈膜的發(fā)育過程。Lan等[6]報道稱全基因組測序標(biāo)識GATA6新發(fā)突變與CDH有關(guān)。Wat等[7]研究證實ZFPM2缺失可引起與不完全外顯性遺傳孤立膈肌缺損。至今國內(nèi)尚無CDH相關(guān)遺傳基因的報道。為此，我們收集了CDH患兒的資料，嘗試篩選CDH的參與基因，現(xiàn)報告如下。

1　研究對象與方法

1.1研究對象2014年2月～2015年5月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院確診的CDH患兒11例。孕婦孕18～30周時通過超聲確診，新生兒出生后當(dāng)天通過超聲檢查再次明確診斷。11例患兒中，1例(患兒1)實驗結(jié)果呈陽性，有異卵雙胞胎兄弟(患兒12)，另一胎出生時被確診為胎兒腸管擴(kuò)張。納入患兒基本情況見表1。

表1　納入患兒基本情況

1.2CDH相關(guān)基因篩選方法孕母分娩后取臍血5 mL，使用Affymetrix Cytoscan 750K陣列平臺進(jìn)行微陣列分析，陣列平臺包括多于550 000標(biāo)記拷貝數(shù)和200 000基因型。

2　結(jié)果

僅患兒1被檢出基因序列異常，包括用268-kb的重復(fù)2q33.1、ARR[hg19]2q33.1(201,303,201-201,571,143)，一個純合性缺失的8p11.22、ARR[hg19]8p11.22(39,226,335-39,388,919)，以及12p13.33雜合性的一部分損失、ARR[hg19]12p13.33(1,262,947-1,375,084)。檢出5個基因發(fā)生序列重復(fù)，包括SPATS2L、KCTD18、Shugoshin樣蛋白2(SGOL2)、醛氧化酶1(AOX1)、醛氧化酶2P(AOX2P)；2個基因發(fā)生純合缺失，為ADAM5、ADAM3A；1個基因發(fā)生雜合性的部分損失，為ERC1。該患兒母親為初產(chǎn)婦，合并妊娠期糖尿病(GDM)，進(jìn)行微陣列分析未檢出基因序列異常。

3　討論

CDH屬于非外傷性膈疝的一種，發(fā)病率為1/4 000～1/2 500，病死率高(約為35%)，最常見者為食管裂孔疝、胸腹裂孔疝、胸骨旁疝和膈缺如等。膈疝癥狀輕重不一，主要決定于疝入胸內(nèi)的腹腔臟器容量、臟器功能障礙的程度和胸內(nèi)壓力增加對呼吸循環(huán)機(jī)能障礙的程度。孕期可通過B超和MRI檢查幫助診斷，新生兒出生后可借助超聲檢查進(jìn)一步明確診斷。目前國外已篩查出CDH部分相關(guān)基因，國內(nèi)無報道。

染色體基因芯片分析(CMA)能在全基因組范圍內(nèi)同時檢測很多種因染色體拷貝數(shù)變異而導(dǎo)致的疾病，已經(jīng)逐步應(yīng)用于多種疾病的臨床診斷和研究。目前，全基因組芯片技術(shù)漸漸用于兒科遺傳疾病篩查[8]，常見應(yīng)用指征包括以下幾個方面：①不明原因的智力落后或發(fā)育遲緩；②非已知綜合征的多發(fā)畸形；③自閉癥譜系障礙及其他精神神經(jīng)發(fā)育障礙。全基因組芯片技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用包括：①產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常者，如核型分析正常，則建議進(jìn)一步行CMA檢查；②胎死宮內(nèi)或死產(chǎn)需行遺傳學(xué)分析者；③胎兒核型分析結(jié)果無法確定染色體畸變情況者。本研究中應(yīng)用的Affymetrix Cytoscan 750k芯片探針涵蓋復(fù)發(fā)性基因組病及常見微缺失/微重復(fù)綜合征區(qū)域，并覆蓋亞端粒區(qū)域；在探針覆蓋區(qū)域可檢測出小至幾十kb的拷貝數(shù)變異；能檢測出已知印記區(qū)域的純合區(qū)。

本研究納入了11例確診先天性膈疝的患兒，并通過全基因組芯片技術(shù)篩選出8個序列異常的基因，但這8個基因均無相關(guān)報道證實與膈疝發(fā)病有關(guān)。SPATS2L在體內(nèi)的功能仍未明確，有學(xué)者[9]研究發(fā)現(xiàn)SPATS2L可能通過下調(diào)β2腎上腺素能受體水平而介導(dǎo)支氣管擴(kuò)張劑反應(yīng)。KCTD18被認(rèn)為與不安腿綜合征(RLS，一種病因不明的綜合征，系指小腿深部于休息時出現(xiàn)難以忍受的不適，運(yùn)動、按摩可暫時緩解的一種綜合征)有關(guān)[10]。SGOL2在哺乳動物卵母細(xì)胞的分離中有重要作用[11]。TRIPIN是著絲粒凝聚力的必要基因，是著絲粒錯誤檢查機(jī)制中的關(guān)鍵部分[12]。AOX1在健康的肝臟及肝硬化組織中表達(dá)，但較少在肝癌組織中表達(dá)，AOX1表達(dá)抑制被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)病有關(guān)。AOX2P未被證實與人類的疾病相關(guān)。ADAM基因可能與細(xì)胞間通信和附著力的調(diào)控有關(guān)。ADAM3A純合性缺失被認(rèn)為在兒科高級別膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用[13]，ADAM3A的過度表達(dá)可能還與結(jié)膜鱗狀細(xì)胞癌(CSCC)有關(guān)[14]。ADAM5已被證實在獼猴精卵結(jié)合中起引導(dǎo)作用，但未被證實與人類有關(guān)。ERC1為IκB激酶(IKK)復(fù)合體的一個必不可少的調(diào)節(jié)亞基，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)病和發(fā)展中起重要作用，ERC1還是蘭伯特-伊頓肌無力綜合征一個罕見的抗原[15]。

綜上所述，雖然本研究僅納入11例患兒，樣本量較小，但有1例患兒檢測出8個基因序列異常，包括SPATS2L、KCTD18、SGOL2、AOX1、AOX2P、ADAM5、ADAM3A和ERC1。鑒于上述基因與CDH發(fā)病的關(guān)系尚未得到證實，本研究結(jié)果有望為CDH發(fā)病原因的后續(xù)研究提供參考方向。

[1] Arrington CB,Bleyl SB,Nori M,et al.A family-based paradigm to identify candidate chromosomal regions for isolated congenital diaphragmatic hernia[J].Am J Med Genet A,2012,158A(12):3137-3147.

[2] Balayla J,Abenhaim HA.Incidence,predictors and outcomes of congenital diaphragmatic hernia: a population-based study of 32 million births in the United States.[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2014,27(14):1438-1444.

[3] Brady PD,Srisupundit K,Devriendt K,et al.Recent Developments in the Genetic Factors Underlying Congenital Diaphragmatic Hernia[J].Fetal Diagn Ther,2011,29(1):25-39.

[4] Wynn J,Yu L,Chung WK.Genetic causes of congenital diaphragmatic hernia[J].Semin Fetal Neonatal Med,2014,19(6):324-330.

[5] Lan Y,Julia W,Lijiang M,et al.De novo copy number variants are associated with congenital diaphragmatic hernia[J].J Med Genet,2012,49(10):650-659.

[6] Lan Y,Bennett JT,Julia W,et al.Whole exome sequencing identifies de novo mutations in GATA6 associated with congenital diaphragmatic hernia[J].J Med Genet,2014,51(3):197-202.

[7] Wat MJ,Danielle V,Jacob H,et al.Genomic alterations that contribute to the development of isolated and non-isolated congenital diaphragmatic hernia[J].J Med Genet,2011,48(5):299-307.

[8] Miller DT,Adam MP,Aradhya S,et al.Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies[J].Am J Hum Genet,2010,86(5):749-764.

[9] Himes BE,Jiang X,Hu R,et al.Genome-Wide Association Analysis in Asthma Subjects Identifies SPATS2L as a Novel Bronchodilator Response Gene[J].PLoS Genet,2012,8(7):656-662.

[10] Pichler I,Schwienbacher C,Zanon A,et al.Fine-mapping of restless legs locus 4 (RLS4) identifies a haplotype over the SPATS2L and KCTD18 genes[J].J Mol Neurosci,2013,49(3):600-605.

[11] Ahmed R,Magda W,Mickael P,et al.Sgol2 provides a regulatory platform that coordinates essential cell cycle processes during meiosis I in oocytes[J].Elife,2013,2(1629):e01133-e01133.

[12] Tanno Y,Kitajima TS,Honda T,et al.Phosphorylation of mammalian Sgo2 by Aurora B recruits PP2A and MCAK to centromeres[J].Genes Dev,2010,24(19):2169-2179.

[13] Barrow J,Adamowicz-Brice M,Cartmill M,et al.Homozygous loss of ADAM3A revealed by genome-wide analysis of pediatric high-grade glioma and diffuse intrinsic pontine gliomas[J].Neuro Oncol,2011,13(2):212-222.

[14] Laura A,Hind A,Alka M,et al.Identification of multiple DNA copy number alterations including frequent 8p11.22 amplification in conjunctival squamous cell carcinoma.[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2014,55(Suppl 252):1694-1706.

[15] Huijbers MG,Lipka AF,Potman M,et al.Antibodies to active zone protein ERC1 in Lambert-Eaton myasthenic syndrome[J].Hum Immunol,2013,74(7):849-851.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.031

R726.5

B

1002-266X(2016)19-0084-03

2015-12-01)