雷帕霉素對(duì)淀粉樣β蛋白所致大鼠工作記憶和突觸可塑性損傷的作用觀察*

郝　明， 仝嘉慶， 張　軍， 武美娜， 祁金順

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系， 細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原 030001)

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雷帕霉素對(duì)淀粉樣β蛋白所致大鼠工作記憶和突觸可塑性損傷的作用觀察*

郝明， 仝嘉慶， 張軍， 武美娜， 祁金順△

(山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系， 細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原 030001)

目的：觀察雷帕霉素對(duì)淀粉樣β蛋白(Aβ1-42)所致大鼠工作記憶和突觸可塑性損傷的影響。方法：SD大鼠(n=44)雙側(cè)海馬注射Aβ1-42建立AD模型，雷帕霉素預(yù)處理后，進(jìn)行Y-迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和在體海馬場(chǎng)電位實(shí)驗(yàn)，分別記錄大鼠在Y-迷宮中的正確交替反應(yīng)率和海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)。結(jié)果：①與對(duì)照組相比，海馬單獨(dú)注射Aβ1-42可導(dǎo)致大鼠Y迷宮試驗(yàn)中工作記憶明顯下降；②單獨(dú)注射雷帕霉素不影響大鼠的工作記憶，但雷帕霉素預(yù)處理可有效逆轉(zhuǎn)Aβ1-42引起的工作記憶損傷；③單獨(dú)注射Aβ1-42明顯壓抑了大鼠在體海馬CA1區(qū)突觸傳遞的LTP效應(yīng)；④雷帕霉素預(yù)處理有效逆轉(zhuǎn)了Aβ1-42引起的LTP壓抑。結(jié)論：雷帕霉素可有效拮抗Aβ1-42所致的大鼠工作記憶和突觸可塑性損害，提示其具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

雷帕霉素；淀粉樣β蛋白；工作記憶；海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)；阿爾茨海默??；大鼠

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能下降、精神行為異常和生活能力下降，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆。AD主要的病理改變是腦內(nèi)細(xì)胞外出現(xiàn)高密度的老年斑、細(xì)胞內(nèi)Tau 蛋白過(guò)度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)以及大量神經(jīng)元丟失。β-淀粉樣蛋白(β-amyloid, Aβ)是老年斑的主要成

分，是淀粉樣前體蛋白(amyloid β precursor protein，APP) 在γ和β分泌酶的作用下裂解而成的一個(gè)多肽，具有廣泛的神經(jīng)毒性。研究證實(shí)，Aβ水平受生成率和清除率的共同影響。在自噬失調(diào)的細(xì)胞中，γ分泌酶活性增強(qiáng)；AD病人早期腦內(nèi)Beclin1蛋白表達(dá)減少，自噬體成熟過(guò)程受阻，自噬減弱，導(dǎo)致Aβ水平增加和老年斑的形成。因此，自噬失調(diào)在AD的發(fā)病過(guò)程中可能起著重要的作用。

雷帕霉素屬大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，與他克莫司(FK506)結(jié)構(gòu)相似，1999年9月由美國(guó)FDA認(rèn)證作為腎移植的免疫抑制藥物投放市場(chǎng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種保守的絲-蘇氨酸蛋白激酶，在多條信號(hào)途徑中發(fā)揮著中心傳感器的效應(yīng)。mTOR包括mTORC1和mTORC2兩個(gè)不同的復(fù)合體。其中，mTORC1由raptor和GβL兩個(gè)蛋白協(xié)助，將整合的信息傳遞給下游的兩個(gè)關(guān)鍵的效應(yīng)分子：S6激酶-1(S6K1)和起始因子4E結(jié)合蛋白-1(4E-BP1)。雷帕霉素則通過(guò)干擾raptor識(shí)別S6K1，從而抑制S6K1磷酸化，導(dǎo)致自噬的發(fā)生。而mTORC2對(duì)雷帕霉素不是很敏感。目前發(fā)現(xiàn)僅mTORC1/ S6K1對(duì)營(yíng)養(yǎng)代謝敏感，mTORC1在自噬調(diào)控中發(fā)揮主要作用[1]。最近報(bào)道，P301S小鼠經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期或短期的雷帕霉素治療后神經(jīng)原纖維纏結(jié)病理性改變明顯減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生減少，主要機(jī)制是雷帕霉素通過(guò)提高自噬水平，清除Aβ和異常磷酸化的Tau 蛋白[2]，從而減少炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而雷帕霉素在行為學(xué)上是否能拮抗Aβ對(duì)大鼠工作記憶的影響仍缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)，在反映學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的突觸傳遞可塑性上是否能保護(hù)海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)免受Aβ的傷害仍未見報(bào)道。本研究在海馬局部注射 Aβ1-42寡聚體建立AD動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，應(yīng)用Y-迷宮自發(fā)性交替實(shí)驗(yàn)和在體海馬場(chǎng)電位記錄手段，觀察了雷帕霉素預(yù)處理對(duì)大鼠工作記憶和LTP的神經(jīng)作用,為AD的發(fā)病機(jī)制及其防治提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及海馬注射

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)成年雄性SD 大鼠，體重 200～230 g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為：12 h/12 h明暗交替、濕度為50%～60%、室溫為 22℃～25℃，自由飲食。將44只大鼠隨機(jī)分為4組(n=11)：vehicle+PBS、vehicle +雷帕霉素(2 μmol)、Aβ1-42 (5 μg)+PBS和Aβ1-42+雷帕霉素。其中，vehicle為生理鹽水，Aβ1-42 (Abcam , USA) 和雷帕霉素 (cell signaling Technology, USA)經(jīng)微量二甲基亞砜 (DMSO) 充分溶解后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)稀釋，濃度分別為2.5 μg/μl和1 μmol/μl。Aβ1-42在37℃下孵育36 h，間斷振蕩，使其老化成寡聚體。DMSO 終濃度小于0.1%，為生理無(wú)效范圍[3, 4]。在水合氯醛 (0.3 g/kg) 麻醉下，將SD 大鼠固定于腦立體定位儀 (RWD68004, RWD Life Science, China) 上。切開頭皮，以前囟點(diǎn) (Bregma) 為基準(zhǔn)，參照大鼠腦立體定位圖譜，用骨鉆鉆孔，而后用石英毛細(xì)給藥管插入雙側(cè)海馬CA1 區(qū) (Bregma后3.0 mm，中線旁開2.2 mm，深度3.0 mm)，再使用微量注射泵 (KDS 310 Plus, KDS scientific, USA) 將藥物或溶劑 (2 μl)緩慢注入雙側(cè)海馬，給藥速度0.2 μl/min。藥物注射完后保留給藥管10 min，然后退出給藥管，用骨蠟封閉創(chuàng)口，縫合皮膚，動(dòng)物恢復(fù)12 d。

1.2Y-迷宮實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物術(shù)后12 d進(jìn)行Y-迷宮實(shí)驗(yàn)，為期1 d。Y-迷宮實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)裝置由三個(gè)夾角為120°的支臂組成，分別稱為A、B、C臂。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠放在三個(gè)臂的交匯點(diǎn)，讓其自由出入三個(gè)臂，記錄8 min內(nèi)每只大鼠進(jìn)入三個(gè)臂的總次數(shù)和順序，以連續(xù)進(jìn)入三個(gè)不同的臂為一次正確交替反應(yīng)，記錄正確交替反應(yīng)次數(shù)。用正確交替反應(yīng)率反映大鼠的工作記憶能力。正確交替反應(yīng)率=正確交替次數(shù)/(進(jìn)臂總次數(shù)-2)×100%。

1.3在體海馬場(chǎng)電位記錄

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，將大鼠經(jīng)腹腔注射烏拉坦(sigma-Aldrich, UK, 1.5 g/kg)麻醉，并固定在腦立體定位儀上。切開頭皮，以前囟點(diǎn)為基準(zhǔn)，參照大鼠腦立體定位圖譜，使用骨鉆鉆孔，將綁定的刺激和記錄電極(Sequim, WA, USA)插入到大鼠海馬CA1區(qū)，記錄場(chǎng)興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)。刺激電極尖端位于海馬Schaffer 側(cè)支/連合通路(Bregma后4.2 mm, 中線旁開3.8 mm)，記錄電極尖端位于海馬CA1區(qū)的放射層(Bregma后3.8 mm, 中線旁開2.5 mm)。先使用電刺激器(Master-9 Pulse Stimulator, AMPI, Israel)給予海馬Schaffer側(cè)支重復(fù)的單個(gè)測(cè)試刺激，穩(wěn)定30 min左右，記錄30 min基礎(chǔ)性fEPSP，而后記錄雙脈沖易化(paired pulse facilitation, PPF)。然后用引起最大fEPSP幅值30%～50%的刺激強(qiáng)度給予高頻刺激(HFS)，誘發(fā)LTP，隨后改為單個(gè)測(cè)試刺激記錄1 h fEPSP。

1.4數(shù)據(jù)分析

2　結(jié)果

2.1雷帕霉素保護(hù)大鼠工作記憶免受Aβ1-42引起的損傷

Y-迷宮中自發(fā)交替反應(yīng)率可以反映工作記憶，是一種測(cè)試動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶有效而客觀的方法。vehicle+PBS、vehicle +雷帕霉素、Aβ1-42+PBS和Aβ1-42+雷帕霉素大鼠在8 min 的自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入Y迷宮3個(gè)臂的總次數(shù)(21.33±2.69、19.83±2.48、20.67±2.43、21.83±2.54)之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A)，表明藥物的給予并沒有影響動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能。然而，雙側(cè)海馬注射Aβ1-42的大鼠在Y迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)中的正確交替反應(yīng)率(59.57±6.21)%較正常對(duì)照組(77.29±2.09)%顯著降低(P<0.01)，表明Aβ1-42可顯著損傷大鼠的工作記憶；單獨(dú)給予雷帕霉素(76.27±4.58)%對(duì)大鼠的工作記憶沒有影響，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但在聯(lián)合給予Aβ1-42組(77.60±5.30)%中，雷帕霉素顯著拮抗了Aβ1-42對(duì)工作記憶的損傷，自發(fā)性交替反應(yīng)正確率較單獨(dú)給予Aβ1-42組明顯增加 (P<0.01，圖1B)。

A：No significant difference in the total number of arm entries in all groups; B：Lower spontaneous alternation of rats after injection of Aβ1-42 alone and a significant recovery in Aβ1-42+rapamycin group

**P<0.01vsPBS+vehicle;?##P<0.01vsPBS+Aβ1-42

2.2雷帕霉素保護(hù)大鼠在體海馬LTP免受Aβ1-42引起的影響

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天，對(duì)同批大鼠進(jìn)行在體海馬場(chǎng)電位fEPSP記錄實(shí)驗(yàn)，觀察雙側(cè)海馬內(nèi)注射Aβ1-42、雷帕霉素及二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠在體海馬fEPSP的LTP的影響。如圖2A和圖2B所示，雙側(cè)海馬注射Aβ1-42不影響CA1區(qū)的基礎(chǔ)性突觸傳遞，但明顯抑制了HFS引起的LTP，fEPSP的平均斜率在HFS后1h末為(114.72±2.54)%，明顯低于對(duì)照組的(134.00±0.79)% (P<0.01)，表明Aβ1-42顯著抑制了海馬CA1區(qū)的LTP維持。單獨(dú)給予雷帕霉素對(duì)基礎(chǔ)fEPSP的斜率和HFS后引起的LTP均沒有影響，與對(duì)照組相比，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；但雷帕霉素可以顯著拮抗Aβ1-42對(duì)LTP的壓抑作用，HFS后1 h末fEPSP的平均斜率保持在(133.72±1.71)%，明顯高于單獨(dú)給予Aβ1-42組的(114.72±2.54)% (P<0.01)。圖2C顯示了各組在HFS前與HFS后1 h典型的fEPSP曲線。

2.3雷帕霉素和Aβ1-42不影響海馬CA1區(qū)雙脈沖易化

為探究雷帕霉素和Aβ1-42在LTP實(shí)驗(yàn)中是否有突觸前機(jī)制的參與，我們進(jìn)一步記錄了海馬CA1區(qū)的PPF。結(jié)果如圖2D所示，給予Schaffer側(cè)支兩個(gè)間隔為50 ms的雙脈沖刺激后，能可靠誘發(fā)和記錄CA1區(qū)的PPF(各組PPF百分為vehicle+PBS：(183.67±1.83)%、vehicle +雷帕霉素：(180.10±2.74)%、Aβ1-42+PBS：(180.94±1.24)%和Aβ1-42+雷帕霉：(185.51%±3.00)%，均沒有顯著差異。這提示兩種藥物對(duì)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放均不構(gòu)成明顯影響。

A and B: Aβ1-42 remarkably suppressed in vivo LTP of fEPSPs in the CA1 region ; C: Typical fEPSP traces in different groups indicated in Fig3A before and after HFS; D: Effects of Aβ1-42 and rapamycin on hippocampal PPF

**P<0.01vsPBS+vehicle;?##P<0.01vsPBS+Aβ1-42

3　討論

AD是一種漸進(jìn)性的神經(jīng)退行性疾病[5]。AD患者有漸進(jìn)性認(rèn)知功能障礙，精神癥狀和行為紊亂。AD的主要病理表現(xiàn)是腦內(nèi)出現(xiàn)高密度的淀粉樣斑塊、神經(jīng)原纖維纏結(jié)、神經(jīng)元的缺失和腦萎縮。其中淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)可以引發(fā)各種免疫炎癥反應(yīng)和神經(jīng)毒性反應(yīng)，引起廣泛的神經(jīng)元變性，甚至死亡[6]。神經(jīng)元變性主要發(fā)生在海馬和大腦皮層，可引起記憶和認(rèn)知功能障礙，最終導(dǎo)致癡呆的發(fā)生。

動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能可以通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，如Morris水迷宮、T迷宮、Y-迷宮以及八臂迷宮實(shí)驗(yàn)等。本研究應(yīng)用Y-迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)，該方法通過(guò)測(cè)定大小鼠工作記憶，可用來(lái)評(píng)價(jià)癡呆動(dòng)物模型成功與否，因而為國(guó)內(nèi)外研究人員在測(cè)試動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶行為時(shí)廣泛使用。工作記憶是一種特殊的短時(shí)性記憶，具有短時(shí)存儲(chǔ)、實(shí)時(shí)刷新和容量有限的特點(diǎn)，也是AD患者早期即出現(xiàn)的常見的認(rèn)知功能障礙。前額葉是工作記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，海馬也在工作記憶中起重要作用。同時(shí)，海馬還參與短期記憶向長(zhǎng)期記憶的轉(zhuǎn)移；海馬的LTP也被認(rèn)為是認(rèn)知記憶的主要細(xì)胞機(jī)制之一。LTP是神經(jīng)元之間的化學(xué)性突觸傳遞功能發(fā)生的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象，其不僅為研究高等動(dòng)物腦內(nèi)活動(dòng)的突觸可塑性提供了有力證據(jù)，而且為研究學(xué)習(xí)記憶的突觸可塑性機(jī)制提供了一個(gè)理想的模型。因此，本研究采用大鼠雙側(cè)海馬注射Aβ1-42建立AD模型，同時(shí)觀測(cè)了大鼠的工作記憶行為學(xué)變化和海馬LTP電生理改變。我們的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：海馬注射Aβ1-42可引起大鼠工作記憶功能的下降；電生理實(shí)驗(yàn)則顯示：海馬注射Aβ1-42可引起LTP壓抑。這些結(jié)果表明該模型是有效的。重要的是，本研究不僅觀察到海馬注射Aβ1-42可以傷害正常大鼠的工作記憶和海馬突觸可塑性，而且發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠逆轉(zhuǎn)Aβ1-42所致的大鼠Y迷宮自發(fā)性交替行為和海馬LTP的損傷。這一結(jié)果表明，雷帕霉素能夠拮抗Aβ1-42的神經(jīng)毒性，保護(hù)大鼠認(rèn)知行為和突觸可塑性免受Aβ1-42的傷害，提示雷帕霉素對(duì)實(shí)驗(yàn)性AD具有一定的防治作用。同時(shí)，雷帕霉素保護(hù)認(rèn)知行為可能與維持海馬正常的突觸可塑性特別是突觸后機(jī)制有關(guān)，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)中能夠反映突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放的PPF沒有發(fā)生明顯變化。

有證據(jù)表明，雷帕霉素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞的自噬活動(dòng)引起的[7]。雷帕霉素可以抑制mTOR，提高自噬水平，通過(guò)增強(qiáng)自噬吞噬清除Aβ和吞噬異常磷酸化的Tau蛋白[8]，起到神經(jīng)保護(hù)和改善AD認(rèn)知功能的作用[9]。自噬不僅參與了Aβ的生成和清除過(guò)程，而且還參與了Tau蛋白的代謝過(guò)程?？磥?lái)，自噬的損傷與失平衡是Aβ在腦內(nèi)聚集、Tau蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化乃至AD 最終發(fā)生的一個(gè)重要的早期因素。AD動(dòng)物模型和AD病人自噬溶酶體功能受損，提示恢復(fù)自噬溶酶體正常功能是治療AD[10]的一種潛在途徑。本研究證實(shí)的雷帕霉素拮抗Aβ神經(jīng)毒性作用是否也與保護(hù)自噬溶酶體功能有關(guān)尚待證實(shí)。但不容置疑的是，雷帕霉素已經(jīng)在治療神經(jīng)退行性疾病如AD、帕金森病和亨廷頓氏病乃至延長(zhǎng)壽命、延緩衰老中顯示出良好的神經(jīng)保護(hù)作用和令人欣慰的實(shí)驗(yàn)效果。盡管目前已有不少研究在揭示自噬與AD之間的關(guān)系，但這一研究領(lǐng)域仍有許多未知因素，針對(duì)自噬途徑開發(fā)靶向預(yù)防和治療AD藥物的前景仍然令人期待。

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Effects of rapamycin on amyloid β-protein induced impairments of working memory and synaptic plasticity in rats

HAO Ming, TONG Jia-qing, ZHANG Jun, WU Mei-na, QI Jin-shun△

(Department of Physiology, Shanxi Medical University, Key Laboratory for Cellular Physiology of Ministry of Education Functional Center of Medical Experiment, Taiyuan 030001, China)

Objective: The present study investigated the effects of rapamycin on Aβ1-42-induced deficits in working memory and synaptic plasticity. Methods: After bilateral hippocampal injection of Aβ1-42 and rapamycinin rats，spontaneous alternationin Y-maze and in vivo hippocampal long-term potentiation (LTP) of rats were recorded. All data were analized by two-way repeated measures analysis of variance (ANOVA). Results: ①Hippocampal injection of Aβ1-42 alone impaired working memory of rats; ②Rapamycin did not affect working memory of rats, but alleviated Aβ1-42-induced working memory deficits, compared with Aβ1-42 alone group; ③Aβ1-42 remarkably suppressed in vivo hippocampal LTP of fEPSPs in the CA1 region; ④Pretreatment with rapamycin prevented Aβ1-42-induced suppression of LTP. Conclusion: These data indicates that rapamycin could protect against Aβ1-42-induced impairments in working memory and synaptic plasticity in rats.

rapamycin；amyloid β protein;working memory；hippocampal long-term potentiation；Alzheimer’s disease；rat

國(guó)家自然科學(xué)基金(31471080，31271201，31300968)；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(2013-054)；山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金(01201105)

2015-03-23

2015-09-18

△Tel：13513604379； E-mail：jinshunqi2009@163.com

R338

A

1000-6834(2016)01-018-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.005