朱，和思揚(yáng)，竇言東

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

熒光探針技術(shù)在谷胱甘肽檢測(cè)中的應(yīng)用

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是細(xì)胞與組織內(nèi)重要的活性小分子，在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。谷胱甘肽具有重要的生產(chǎn)以及研究?jī)r(jià)值，因此如何對(duì)其進(jìn)行高效且專一地檢測(cè)已成為當(dāng)前谷胱甘肽工業(yè)生產(chǎn)及其功能研究的重要課題。熒光探針作為一種新型的檢測(cè)手段，具有靈敏度高、專一性強(qiáng)以及制備成本低等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各類小分子檢測(cè)。近年來，已經(jīng)有諸多檢測(cè)谷胱甘肽的熒光探針被報(bào)道，且均表現(xiàn)出良好的檢測(cè)性能。對(duì)近些年來不同類型的谷胱甘肽探針進(jìn)行綜述并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

谷胱甘肽；熒光探針；專一性檢測(cè)

內(nèi)源性生物硫醇類小分子是生物體所必須的一種活性物質(zhì)，該類物質(zhì)對(duì)調(diào)控機(jī)體氧化還原水平具有十分重要的意義［1-2］。在眾多硫醇物質(zhì)中，谷胱甘肽在機(jī)體內(nèi)分布十分普遍，參與了諸多與氧化還原相關(guān)的重要代謝途徑［3］，使細(xì)胞具有抗毒性作用，對(duì)細(xì)胞具有重要的防護(hù)作用［4-5］。同時(shí)，谷胱甘肽的異常代謝和許多疾病有密切關(guān)聯(lián)，如白細(xì)胞損傷、肝臟與皮膚病、癌癥、艾滋病等［6-7］。除此之外，谷胱甘肽也是一種重要的工業(yè)產(chǎn)品，并被越來越多地應(yīng)用于醫(yī)藥保健產(chǎn)品、養(yǎng)生美容產(chǎn)品以及食品和飼料添加劑等。當(dāng)前，谷胱甘肽的生產(chǎn)主要通過大規(guī)模發(fā)酵來實(shí)現(xiàn)。由于谷胱甘肽在工業(yè)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有十分重要的價(jià)值，因此，無數(shù)的國內(nèi)外科研人員針對(duì)其定量檢測(cè)這一熱點(diǎn)問題進(jìn)行了諸多的研究。因此，設(shè)計(jì)專一快捷的谷胱甘肽檢測(cè)手段具有重要意義。

目前，針對(duì)谷胱甘肽等小分子的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有比色法［8］、分光光度法［9］、電化學(xué)測(cè)量［10］、酶催化法［11］以及高效液相色譜法［12］等。這些傳統(tǒng)檢測(cè)手段在谷胱甘肽定量檢測(cè)方面具備各自的優(yōu)點(diǎn)，但是這些手段的操作相對(duì)復(fù)雜，設(shè)施成本、要求過高，同時(shí)檢測(cè)的專一性不佳。近些年來，隨著熒光探針在小分子檢測(cè)領(lǐng)域中的不斷發(fā)展完善，該技術(shù)已被逐漸應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)中PCR定量檢測(cè)等領(lǐng)域，并在生物檢測(cè)行業(yè)發(fā)揮著重要作用。熒光探針通過與分析物發(fā)生特異反應(yīng)并使其熒光性質(zhì)發(fā)生較大改變而實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的檢測(cè)，該方法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速以及專一性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)過不斷地完善，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于不同類型物質(zhì)的特異性檢測(cè)。除了工業(yè)與環(huán)境檢測(cè)之外，探針也被逐漸用于檢測(cè)更為復(fù)雜的生物體系。目前的研究證明，對(duì)于諸多炎癥與癌癥，尤其是肝癌等疾病，其病變細(xì)胞的谷胱甘肽分泌量往往是正常細(xì)胞的數(shù)倍，由于谷胱甘肽的定量檢測(cè)對(duì)于病變細(xì)胞的診斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值，因此，開發(fā)出高效且靈敏的谷胱甘肽熒光探針對(duì)病理學(xué)研究意義十分重大。

1　基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機(jī)制的熒光探針

分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer，ICT）是目前最為常見的探針類型。這類熒光探針具有易于制備、信號(hào)表達(dá)強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)。目前已有諸多ICT探針被用于谷胱甘肽檢測(cè)。這類探針包含著推拉電子體系，通過識(shí)別基團(tuán)與待分析物的反應(yīng)改變?cè)镜耐评娮芋w系，使熒光增強(qiáng)或者波長(zhǎng)位移。ICT類探針往往將檢測(cè)位點(diǎn)與熒光分子直接相連，因此具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、易于制備、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。ICT類熒光探針是最為常規(guī)且普遍的探針類型。2013年，Wei等［13］基于香豆素設(shè)計(jì)出了ICT熒光探針。如圖1所示：香豆素7位氨基具有推電子能力，而磺酰胺結(jié)構(gòu)吸電子能力極強(qiáng)，與探針結(jié)合后7位供電能力減弱，熒光強(qiáng)度明顯下降。隨著谷胱甘肽濃度升高，磺酰胺被破壞，使7位推電子能力增強(qiáng)并產(chǎn)生熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針對(duì)谷胱甘肽檢測(cè)的信號(hào)顯著、反應(yīng)迅速、專一性較高，在所檢測(cè)的多種金屬離子與氨基酸中，探針表現(xiàn)出良好的抗干擾性。

2014年，Yin等［14］設(shè)計(jì)合成了基于菁染料的熒光探針，具有強(qiáng)烈吸電子作用的磺酰胺結(jié)構(gòu)通過哌嗪與熒光分子相連，這一結(jié)構(gòu)對(duì)熒光分子的吸電子能力較強(qiáng)，因而造成熒光淬滅。除此之外，該結(jié)構(gòu)也可以作為特異性識(shí)別谷胱甘肽的反應(yīng)位點(diǎn)。當(dāng)探針與谷胱甘肽反應(yīng)后，哌嗪結(jié)構(gòu)被谷胱甘肽取代并脫落，造成探針的推拉電子體系改變，熒光增強(qiáng)。該探針有著更好的專一性與敏感性，由于其具有近紅外檢測(cè)的性能，使外界光激發(fā)對(duì)細(xì)胞的破壞大大減少。該探針被成功應(yīng)用于胞內(nèi)近紅外成像，并進(jìn)一步被用于小鼠體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，這對(duì)谷胱甘肽在機(jī)體內(nèi)的病理學(xué)研究具有十分重大的意義。

2　基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制的熒光探針

近些年來，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（photoinduced electron transfer，PET）機(jī)制已經(jīng)被廣泛用于熒光探針的設(shè)計(jì)。通常這類探針是由熒光團(tuán)母體與檢測(cè)基團(tuán)通過一定的方式相連，而檢測(cè)基團(tuán)在外界光激發(fā)下以電子轉(zhuǎn)移的方式使探針母體的熒光淬滅，當(dāng)與待分析物作用時(shí)，檢測(cè)基團(tuán)受到破壞使熒光得以復(fù)蘇。相較于一般的ICT探針，基于PET機(jī)制的探針往往能將熒光淬滅完全，能夠更大程度地消除背景熒光，因此在檢測(cè)之后具有更高倍數(shù)的熒光增強(qiáng)。PET機(jī)制由于其淬滅程度高，往往被應(yīng)用于OFF-ON型探針的設(shè)計(jì)。

2014年，Lim［15］合成了菁染料OFF-ON型探針，偶氮聯(lián)苯作為PET淬滅基團(tuán)，在處于被光激發(fā)的狀態(tài)下，其電子會(huì)自發(fā)轉(zhuǎn)移到熒光分子母體，阻礙熒光分子本身的激發(fā)態(tài)電子向低能級(jí)躍遷，并進(jìn)一步造成熒光淬滅。隨著谷胱甘肽加入，偶氮聯(lián)苯脫落，PET效應(yīng)被阻斷，熒光恢復(fù)。該探針具有線粒體靶向性以及近紅外檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。隨著谷胱甘肽的加入，探針的發(fā)射光譜發(fā)生明顯的紅移，且在810 nm處熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該探針的檢測(cè)特異性以及靈敏度均十分良好。

2016年，Pang等［16］利用谷胱甘肽的還原能力，設(shè)計(jì)了基于硫醇對(duì)烯烴還原的谷胱甘肽探針。硝乙烯基通過PET機(jī)制對(duì)熒光基團(tuán)母體具有強(qiáng)烈的淬滅作用，同時(shí)烯烴結(jié)構(gòu)可特異性識(shí)別谷胱甘肽。通過谷胱甘肽與雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)，PET效應(yīng)被阻斷，熒光恢復(fù)的同時(shí)發(fā)生波長(zhǎng)位移。隨著谷胱甘肽加入，發(fā)射光譜從480 nm藍(lán)移至420 nm，且強(qiáng)度顯著增加。該探針可以有效防止半胱氨酸（cysteine，Cys）與同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）等其他硫醇分子對(duì)檢測(cè)的干擾，特異性良好。

3　基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光機(jī)制的熒光探針

2001年，唐本忠的研究小組［17］發(fā)現(xiàn)，一些熒光基團(tuán)在水溶狀態(tài)下，可以將外界光能以分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)或旋轉(zhuǎn)等途徑進(jìn)行耗散，在這種情況下沒有熒光產(chǎn)生。而在高度聚集狀態(tài)下，由于相互之間位阻效應(yīng)導(dǎo)致原本的耗散途徑受阻，其能量只能以熒光發(fā)射的途徑發(fā)出，這種現(xiàn)象稱為聚集誘導(dǎo)發(fā)光效應(yīng)（aggregation induced emission，AIE）。其中，四苯乙烯由于其高熒光量子產(chǎn)率，常被用于AIE探針的母體基團(tuán)。這類探針是通過檢測(cè)物與修飾基團(tuán)的作用，改變其水溶性，從而改變熒光性能，并用作探針進(jìn)行物質(zhì)檢測(cè)。由于熒光物質(zhì)往往具有苯環(huán)等不易溶的剛性結(jié)構(gòu)，在水溶液中具有聚集的趨勢(shì)，而傳統(tǒng)熒光分子在聚集狀態(tài)下往往會(huì)造成熒光信號(hào)的大幅度下降甚至淬滅，因此很大程度上限制了其在檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。而AIE探針可以避免此類不利因素，相較其他熒光探針具有更好的發(fā)光性能。盡管目前關(guān)于AIE的探針報(bào)道較少，但是其優(yōu)越的性能為探針的熒光檢測(cè)提供了新的途徑。

2014年，Lou等［18］基于四苯乙烯獨(dú)特的AIE性能設(shè)計(jì)了新型谷胱甘肽熒光探針。探針在初始狀態(tài)下幾乎沒有熒光發(fā)射，當(dāng)檢測(cè)基團(tuán)與谷胱甘肽發(fā)生加成反應(yīng)，導(dǎo)致其溶解性減弱，發(fā)生聚集，同時(shí)造成熒光增強(qiáng)。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著谷胱甘肽濃度的升高，探針在520 nm處熒光發(fā)射出現(xiàn)了顯著的增強(qiáng)。經(jīng)過與Cys、Hcy以及其他氨基酸的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，探針與其他物質(zhì)幾乎不發(fā)生反應(yīng)，探針的專一性良好、抗干擾性強(qiáng)。

4　基于探針共軛結(jié)構(gòu)改變的熒光探針

大多數(shù)熒光探針與檢測(cè)物作用后，會(huì)造成修飾基團(tuán)離去或者改變，探針的基本結(jié)構(gòu)保持不變。而部分探針則通過與谷胱甘肽反應(yīng)，會(huì)較大程度改變探針的基本結(jié)構(gòu)，其原有的共軛體系被大幅度破壞，并轉(zhuǎn)化為新的結(jié)構(gòu)。目前多數(shù)針對(duì)谷胱甘肽檢測(cè)的探針往往會(huì)受到其他硫醇結(jié)構(gòu)的影響。而該類探針多數(shù)基于谷胱甘肽對(duì)碳碳雙鍵的特異性還原或者羅丹明開環(huán)等原理進(jìn)行設(shè)計(jì)，特異性更高，Hcy與Cys等物質(zhì)對(duì)探針的影響往往可忽略不計(jì)，具有以往探針不具備的專一性與抗干擾能力，在谷胱甘肽特異性檢測(cè)方面帶來了新的突破。

2014年，Dai等［19］合成了高選擇性雙光子熒光探針，探針的初始結(jié)構(gòu)幾乎不發(fā)出熒光信號(hào)，其中丙烯酸酯結(jié)構(gòu)可以特異性識(shí)別谷胱甘肽，通過與谷胱甘肽結(jié)合后丙烯酸酯被破壞，熒光分子開始發(fā)出信號(hào)。谷胱甘肽的加入可使探針熒光增強(qiáng)27倍，同時(shí)該探針具有雙光子激發(fā)的優(yōu)勢(shì)，可以有效檢測(cè)小牛血清中的谷胱甘肽。探針的靈敏度極高，其檢測(cè)下限接近納摩爾級(jí)，具備以往探針無法比擬的檢測(cè)精度。該探針也可以有效區(qū)分谷胱甘肽與其他硫醇結(jié)構(gòu)，如Hcy與Cys等。

2014年，Wang等［20］基于羅丹明開環(huán)原理設(shè)計(jì)熒光探針。兩側(cè)的間二硝基均作為谷胱甘肽的檢測(cè)基團(tuán)。閉環(huán)狀態(tài)下的羅丹明不具備共軛結(jié)構(gòu)，因此不發(fā)出熒光，隨著谷胱甘肽加入，兩側(cè)的檢測(cè)基團(tuán)與之作用后被離去，導(dǎo)致探針一系列電子重排并使羅丹明開環(huán)，熒光顯著增強(qiáng)。由于具備兩個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，該探針在快速響應(yīng)以及高專一性等方面比其他探針有著更為顯著的優(yōu)點(diǎn)，Cys與Hcy等對(duì)其干擾幾乎可以忽略不計(jì)。

2014年，Jiang等［21］設(shè)計(jì)合成了基于雙鍵還原的谷胱甘肽探針，隨著谷胱甘肽的加入，探針的碳碳雙鍵被還原，其原本的共軛結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，導(dǎo)致探針的發(fā)射波長(zhǎng)從488 nm大幅度藍(lán)移至405 nm。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)探針的熒光呈現(xiàn)比率變化、抗干擾性強(qiáng)、細(xì)胞檢測(cè)性能優(yōu)越，可作為比率熒光探針。

5　結(jié)論

本文針對(duì)各種類型的谷胱甘肽探針進(jìn)行簡(jiǎn)要概括，總結(jié)了近年谷胱甘肽探針檢測(cè)的應(yīng)用以及發(fā)展階段。熒光探針作為一種新型的檢測(cè)工具，隨著多年來的開發(fā)被不斷完善，已被設(shè)計(jì)成一種比傳統(tǒng)方法更為高效、靈敏以及簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段，廣泛應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵及環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。同時(shí)，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)展尤為迅速，已被用于組織乃至動(dòng)物體內(nèi)的谷胱甘肽檢測(cè)。目前，谷胱甘肽探針除了用于檢測(cè)病變與腫瘤細(xì)胞，也被用作監(jiān)測(cè)抗癌藥物緩釋的信號(hào)分子，在腫瘤診斷方面有著廣泛的發(fā)展前景。熒光探針有著巨大的發(fā)展?jié)摿Γ?jīng)過不斷的研究，最終會(huì)成為一種被各個(gè)領(lǐng)域普遍應(yīng)用的檢測(cè)手段。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

App lication of fluorescence probes in glutathione detection

ZHU Qing，HE Siyang，DOU Yandong
（College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Glutathione，an important active smallmolecule in cells and tissues，is widely used in the field of industrial production and primarily obtained by large-scale fermentation.Therefore，the efficient and specific detection of glutathione has become an important issue in its industrial production and functional studies.As a new kind of detectionmethod，the fluorescent probe has the advantages of high sensitivity，strong specificity and low preparation costand has been widely used in many kinds of smallmolecule detection.In recent years，many fluorescent probes used to detect glutathione had been reported and showed good detection performance.This paper summarized the different kinds of glutathione probes and theirmechanismswere also briefly introduced.

glutathione；fluorescent probe；specific detection

O64

A

1674-2214（2016）03-0170-05

2016-05-16

新型近紅外水解酶FRET探針設(shè)計(jì)、制備及可視化研究（21272212）

朱（1970—），浙江義烏人，教授，博士，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)生物學(xué)，E-mail：zhuq@zjut.edu.cn.