劉春來,　王　爽,　夏吉星,　楊　帆,　李新民, 孟慶林,　劉　宇,　蘇寶華,　張勻華

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 哈爾濱　150086)

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內(nèi)蒙古和黑龍江的核盤菌菌絲融合群分化及致病性研究

劉春來,王爽,夏吉星,楊帆,李新民, 孟慶林,劉宇,蘇寶華,張勻華*

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 哈爾濱150086)

為明確核盤菌的遺傳多樣性,對(duì)采自內(nèi)蒙古和黑龍江不同地區(qū)的44株核盤菌進(jìn)行了菌絲融合群確定,并比較了不同菌絲融合群間菌絲生長(zhǎng)速度、致病力、草酸和總酸產(chǎn)量的差異。結(jié)果表明:供試44個(gè)菌株分為25個(gè)融合群,其中有14個(gè)融合群僅由單一菌株組成,所占比例為56.0%。菌絲融合群內(nèi)和菌絲融合群間菌絲生長(zhǎng)速度、致病力、草酸和總酸產(chǎn)量都表現(xiàn)出顯著差異(P <0.001),并與菌株的地理來源無關(guān)。相關(guān)分析表明核盤菌菌株的致病力與菌株草酸產(chǎn)量呈正相關(guān)(r=0.484, P ≤0.01),與pH呈負(fù)相關(guān)(r =-0.580, P ≤0.01),與菌株的生長(zhǎng)速度無關(guān);草酸產(chǎn)量與pH高低(表示總酸的分泌量)負(fù)相關(guān)(r=-0.392, P ≤0.01),進(jìn)一步表明核盤菌菌株產(chǎn)生的總酸中草酸量占了很大的比例。

核盤菌;草酸;致病性;生長(zhǎng)速度

核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)deBary]是一種具有廣泛寄主范圍和地理分布的病原菌。它至少能夠引起75個(gè)科、278個(gè)屬和408個(gè)種及42個(gè)變種或亞種的植物發(fā)生病害,其中包括許多重要的蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物[1]。該菌的生活周期中90%是以菌核的形式在土壤中度過的,菌絲體和子囊孢子出現(xiàn)的時(shí)間都較為短暫,由于菌核抗逆性很強(qiáng),使得核盤菌成為一種較難防治的病原菌[2]。

菌絲融合群(myceliacompatibilitygroups,MCGs) 檢測(cè)是通過真菌多位點(diǎn)基因控制的自我或非自我識(shí)別分類系統(tǒng),是一種基于宏觀和表型的研究[3]。Kohn等鑒定了田間作物核盤菌的克隆種群并表明幾個(gè)克隆種群可侵染同一田塊[4]。MCGs是檢測(cè)克隆種群的標(biāo)準(zhǔn)方法之一,當(dāng)配對(duì)培養(yǎng)時(shí),同一個(gè)菌絲融合群的所有菌株能夠融合形成一個(gè)均勻一致的菌落,無反應(yīng)線產(chǎn)生。同時(shí),這些菌株也共有唯一的DNA指紋圖譜[3,5]。目前,菌絲親和性已被證明是研究核盤菌群體結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性的有效方法并得到了廣泛的應(yīng)用[610]。

草酸(OA)被認(rèn)為是核盤菌致病的一種重要的決定性因素[11]。目前,研究的熱點(diǎn)也主要集中于核盤菌產(chǎn)生草酸的量及草酸參與發(fā)病機(jī)制的作用機(jī)理:(1)降低了被侵染組織的pH水平,增強(qiáng)了病菌分泌的胞外酶的活性[12];(2)草酸根陰離子螯合了細(xì)胞壁Ca2+,軟化了植物細(xì)胞壁并削弱了以Ca2+為基礎(chǔ)的防御反應(yīng)功能[12];(3)對(duì)寄主植物產(chǎn)生直接的毒害作用,弱化了植物,有利于病原菌入侵[13];(4)抑制了寄主植物活性氧迸發(fā)[14]。所以,草酸在核盤菌的致病過程研究中起到了非常重要的作用。

研究確定不同融合群與主要致病因子之一草酸之間的聯(lián)系,將為核盤菌病害的防治提供理論依據(jù)。本研究的主要目的是確定來自內(nèi)蒙古和黑龍江不同地區(qū)的44株核盤菌的菌絲融合群,并綜合比較不同融合群間致病性差異與菌株致病力、菌絲生長(zhǎng)速度、草酸和總酸產(chǎn)量間的關(guān)系,分析這些因子與致病性的相關(guān)關(guān)系。

1　材料與方法

1.1供試菌株

研究所用44株核盤菌(S.sclerotiorum)菌株主要來源于內(nèi)蒙古阿榮旗孤山鎮(zhèn)和黑龍江省不同地區(qū)(包括哈爾濱、齊齊哈爾、牡丹江、佳木斯、大慶、綏化、黑河、雙鴨山、鶴崗等地區(qū)),分離菌株的寄主植物主要為向日葵、大豆、紅小豆和菜豆(見表1)。供試菌株均由不同地區(qū)發(fā)病植株上的菌核經(jīng)75%乙醇浸泡30s,再用1‰升汞表面消毒3～5min后,經(jīng)無菌水洗滌3次,轉(zhuǎn)移至PDA平板上培養(yǎng)3d,用接種針挑取先端菌絲至少3次,使其成為遺傳穩(wěn)定菌株。

表1　來自不同地區(qū)寄主植株上的核盤菌菌株1)

1) 采自內(nèi)蒙古地區(qū)的菌株來源于同一地塊。

StrainswerefromthesamefieldinInnerMongolia.

1.2核盤菌菌絲體融合群測(cè)定方法

用打孔器在培養(yǎng)2～3d的菌落邊緣打取生長(zhǎng)速度一致的菌餅(d=7mm),每?jī)蓚€(gè)菌株接種到同一個(gè)含50mg/L的溴酚藍(lán)(bromophenolblue,BPB)馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板上,兩菌餅相距5cm。其中溴酚藍(lán)的作用主要是更加清楚地觀測(cè)到菌絲不親和的反應(yīng)線。作為親和組的對(duì)照,每一個(gè)菌株本身也進(jìn)行了成對(duì)的比較。接種后的培養(yǎng)皿在23～25℃恒溫下暗培養(yǎng)7d。測(cè)定的原則,首先選取來自同一個(gè)地區(qū)的核盤菌菌株進(jìn)行培養(yǎng),測(cè)定出它們的融合群。然后,每一個(gè)融合群選取一個(gè)代表菌株分別與其他融合群的代表菌株進(jìn)行親和性檢測(cè)。當(dāng)兩個(gè)菌落交匯處具有一條黃色分界線或黃色到綠色的反應(yīng)線說明這兩個(gè)菌株不親和,不屬于同一個(gè)菌絲融合群;而兩個(gè)菌落間沒有明顯的反應(yīng)線,兩者生長(zhǎng)融合為一體的為融合,屬于一個(gè)菌絲融合群,每次融合群測(cè)定設(shè)3個(gè)重復(fù),并且對(duì)有疑問的親和組再進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

1.3核盤菌菌株生長(zhǎng)速度測(cè)定方法

菌株經(jīng)純化接入PDA平板上,待菌株培養(yǎng)2～3d后,于菌落邊緣打取d=7mm的菌碟,轉(zhuǎn)接至裝有PDA(含50mg/LBPB)平板的中央位置,接種后的培養(yǎng)皿用Parafilm膜封好,放于恒溫培養(yǎng)箱中 23～25℃黑暗培養(yǎng)48h后,測(cè)量菌落直徑,各菌株重復(fù)4次,以確定不同菌株生長(zhǎng)速度的差異。

1.4核盤菌菌株對(duì)向日葵致病力測(cè)定

取長(zhǎng)方形塑料盤,用75%乙醇棉擦拭盤面。在塑料盤底部鋪兩層滅過菌的吸水濾紙,倒入適量無菌水使得吸水濾紙剛好完全濕潤(rùn)。取苗齡為30d左右的大小較為一致的向日葵(‘豐葵雜1號(hào)’)葉片,自來水沖洗干凈,用吸水濾紙吸干葉片表面多余水分,然后將葉片均勻地放于瓷盤內(nèi),葉片背面朝上。用打孔器在菌落的邊緣打取菌絲瓊脂塊(d=4mm),再用接菌針挑取單個(gè)菌絲瓊脂塊,準(zhǔn)確接種在葉片主葉脈的兩側(cè),每個(gè)菌株接種5個(gè)葉片,每個(gè)葉片接種1個(gè)菌絲瓊脂塊,以沒有接菌的瓊脂塊作為接種對(duì)照。接種后,用保鮮膜封住塑料盤,置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(23～25℃)。48h后觀察發(fā)病情況,用十字交叉法量取病斑直徑大小。

1.5核盤菌菌株產(chǎn)草酸(OA)能力和pH測(cè)定方法

于生長(zhǎng)一致的菌落邊緣打取1個(gè)直徑7mm的菌碟,轉(zhuǎn)至50mL三角瓶中(含30mLPDB,2%葡萄糖和0.4%馬鈴薯液,用蒸餾水配制),室溫靜止培養(yǎng)3d。真空抽濾到已干燥并稱重好的濾紙上,將帶有菌絲體的濾紙?jiān)诠娘L(fēng)干燥箱中干燥至恒重,并測(cè)得帶有菌絲體濾紙的重量,減去濾紙自身的重量得到干菌絲體的重量。上清液用于草酸和pH(用pH計(jì))的測(cè)定。

草酸的測(cè)定參考Durman等[15]的方法,反應(yīng)液包含:0.2mL的樣品液(或標(biāo)準(zhǔn)草酸溶液),0.11mL的BPB(1mmol/L),0.198mL的硫酸(1mol/L),0.176mL(100mmol/L)的重鉻酸鉀,4.8mL蒸餾水。將混合物放入60℃的水浴鍋中反應(yīng)10min后,加入0.5mL(1.0mol/L)氫氧化鈉溶液終止反應(yīng)。然后在分光光度計(jì)(T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì))中測(cè)定600nm的吸光值,PDB溶液作為對(duì)照。菌株產(chǎn)草酸的量通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計(jì)算出,并以μg草酸/mg干菌絲來表示。各菌株總酸的產(chǎn)量通過pH計(jì)(賽多利斯PB-10)測(cè)定溶液的pH來表示。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.6數(shù)據(jù)分析

確定的25個(gè)菌絲融合群菌株的菌絲生長(zhǎng)速度、致病力、pH及草酸產(chǎn)量的數(shù)據(jù)采用單一變量方差分析,最小顯著差異測(cè)定(OnewayANOVA:LSDtest)。不同菌絲融合群的菌絲體生長(zhǎng)速度、致病力、pH及草酸產(chǎn)量的平均數(shù)用于分析4個(gè)因素之間的相關(guān)關(guān)系。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0軟件分析完成。

2　結(jié)果與分析

2.1菌絲體融合群的確定

由表2可知,44株供試菌株共分成25個(gè)融合群。其中有14個(gè)融合群僅由單一菌株組成,所占比例為56.0%。最大的融合群為MCG3,分別由來自內(nèi)蒙古,黑龍江雙鴨山、綏化3個(gè)地區(qū)的5個(gè)菌株組成;其他的融合群分別由2～4個(gè)菌株組成。通過對(duì)44株供試菌株進(jìn)行菌絲融合群測(cè)定表明,采集自內(nèi)蒙古和黑龍江省內(nèi)的核盤菌菌株存在著豐富的遺傳多樣性,表現(xiàn)在同一地區(qū)內(nèi)的菌株可被分成不同的融合群,同一地區(qū)同一田塊采集的菌株也被分在了不同的融合群(如內(nèi)蒙古地區(qū)菌株)。

表2　菌絲融合群分組結(jié)果

2.2菌株生長(zhǎng)速度測(cè)定結(jié)果

供試菌株在PDA(加BPB)培養(yǎng)基上都生長(zhǎng)迅速。培養(yǎng)48h后測(cè)定菌落直徑范圍，最小為2.30cm(M13菌株)，最大直徑為8.62cm(QQ7菌株)。菌株生長(zhǎng)速度表現(xiàn)出顯著差異,并與菌株地理來源和菌絲融和群無關(guān)(數(shù)據(jù)未給出)。當(dāng)利用菌絲融合群方法對(duì)供試菌株進(jìn)行分組,培養(yǎng)48h后菌落平均直徑變化范圍為最小2.32cm(MCG23)到最大8.56cm(MCG11)(表3),融合群間菌絲的生長(zhǎng)速度達(dá)極顯著差異(P<0.001)(表4)。 這種極顯著差異不僅表現(xiàn)在來源于不同地區(qū)融合群間,如來源于齊齊哈爾的MCG11、來源于牡丹江的MCG23和來源于綏化的MCG14,而且表現(xiàn)為來源于同一地區(qū)的融合群間,如來源于牡丹江的MCG20菌絲平均生長(zhǎng)速度比MCG22和MCG23快(表2～3)。

表3　核盤菌不同菌絲融合群生長(zhǎng)速度、病斑直徑、pH及草酸產(chǎn)量1)

1) 按鄧肯新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)(P=0.01),同列后附不同字母的均值有極顯著差異。

DatawithinsamecolumnfollowedbydifferentletterswereextremelysignificantdifferentaccordingtoDuncan’smultiplerangetestat0.01probabilitylevel.

2.3核盤菌對(duì)向日葵品種致病力測(cè)定結(jié)果

利用菌碟貼接離體向日葵葉片,經(jīng)保濕培養(yǎng),12h后在葉片上即可出現(xiàn)明顯的水浸狀病斑,隨保濕時(shí)間的延長(zhǎng)病斑生長(zhǎng)迅速。48h測(cè)定病斑直徑的大小從1.20cm(M13菌株)到5.10cm(S3菌株)。從融合群間看,病斑直徑的差異達(dá)到了極顯著性水平(P<0.001)(見表4),病斑直徑變化的范圍為1.18cm(MCG23)到5.10cm(MCG13)(見表3)。不同菌株間及親合群間致病力的顯著性差異未發(fā)現(xiàn)與菌株的地理來源有關(guān)。

2.4核盤菌產(chǎn)草酸(OA)能力和pH測(cè)定結(jié)果

不同的融合群之間,菌株產(chǎn)草酸的量變化范圍為1.48 (MCG23)到34.02(MCG13)μg/mg干菌絲(見表3)。融合群間草酸產(chǎn)生能力差異很大,并達(dá)到了極顯著差異(P<0.001)(見表4)。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)這種極顯著差異不僅表現(xiàn)在所劃分的所有不同融合群間,也表現(xiàn)在同一地區(qū)的不同融合群間,例如來源于牡丹江地區(qū)的不同融合群間,MCG21比MCG22、MCG23和MCG24產(chǎn)生草酸的量都多。

菌株在液體培養(yǎng)的過程中除了產(chǎn)生草酸外,還可能產(chǎn)生其他的未知酸類物質(zhì),致使培養(yǎng)液的pH產(chǎn)生很大的變化。測(cè)定結(jié)果顯示未接入菌碟前原始培養(yǎng)液(CK)的平均pH為5.03,接入菌后MCG13培養(yǎng)液的pH最小,達(dá)到了3.43(表3)。當(dāng)以pH(表示總酸的分泌量)變化比較各融合群間總酸產(chǎn)量差異時(shí),各融合群間表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.001)(表4)。MCG13產(chǎn)生的總酸量最大(pH=3.43),而MCG23產(chǎn)生的總酸量最小(pH=4.83)(表3)。

2.5與致病力有關(guān)的4個(gè)因子間的相關(guān)性分析

通過對(duì)菌株生長(zhǎng)速度、病斑直徑、草酸產(chǎn)量及培養(yǎng)液pH進(jìn)行相關(guān)性分析(表5)。結(jié)果表明,菌株的致病力與菌株產(chǎn)生的草酸量呈正相關(guān)(r=0.484, P≤0.01),與產(chǎn)生的總酸(pH)之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.580, P ≤0.01),與菌株的生長(zhǎng)速度無關(guān);而生長(zhǎng)速度與菌株產(chǎn)草酸量、總酸及致病力都無關(guān);草酸產(chǎn)量與菌株產(chǎn)生總酸(pH)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.392, P≤0.01),也就說明了總酸的產(chǎn)量與草酸的釋放間存在明顯的相關(guān)關(guān)系,進(jìn)一步表明核盤菌菌株產(chǎn)生的總酸中草酸量占了很大的比例。

表4　核盤菌不同融合群間生長(zhǎng)速度、病斑直徑、pH及草酸產(chǎn)量方差分析表

表5　菌絲體融合群間菌絲生長(zhǎng)速度、病斑直徑、草酸產(chǎn)量和總酸產(chǎn)量的相關(guān)性分析1)

1) 表中數(shù)據(jù)為相關(guān)系數(shù)(r),**代表相關(guān)顯著性水平P≤0.01。

Datainthetablearecorrelationcoefficient(r),**indicatecorrelationissignificantat0.01level.

3　討論

本研究對(duì)采集于內(nèi)蒙古一個(gè)地區(qū)和黑龍江省不同地區(qū)的核盤菌種群進(jìn)行了融合群分析,44個(gè)菌株被分為25個(gè)融合群,其中有14個(gè)融合群僅由單一菌株組成,所占比例為56.0%。初步說明供試菌株存在較大的異質(zhì)性,這與國內(nèi)外相關(guān)研究報(bào)道的結(jié)果相符。Osofee等[9]對(duì)25個(gè)菌株進(jìn)行親和性測(cè)定得到的17個(gè)菌絲融合群(MCGs)中,13個(gè)是由單個(gè)僅與自身親和的菌株組成;Li等[10]對(duì)205個(gè)菌株進(jìn)行菌絲融合性測(cè)定得到的39個(gè)菌絲融合群(MCGs)中,61%是由單個(gè)僅與自身親和的菌株組成;Barari等[16]進(jìn)行菌絲融合性測(cè)定得到的39個(gè)菌絲融合群(MCGs)中,26個(gè)是由單個(gè)僅與自身親和的菌株組成;李偉[17]對(duì)采集自江蘇省范圍內(nèi)的145株油菜菌核病菌菌株進(jìn)行了菌絲融合性測(cè)定,共鑒定出了131個(gè)菌絲融合群,其中114個(gè)是由單個(gè)僅與自身親和的菌株組成; 李沛利等[18]對(duì)四川不同生態(tài)環(huán)境和寄主來源的80個(gè)核盤菌菌株進(jìn)行了菌絲融合性測(cè)定,得到63個(gè)菌絲體融合群(MCGs),其中52個(gè)菌絲融合群(MCGs)是由單個(gè)僅與自身親和的菌株組成;楊丹[19]對(duì)來自湖北省10個(gè)縣市的60個(gè)油菜核盤菌進(jìn)行菌絲融合性的測(cè)定,分為27個(gè)融合群,其中12個(gè)僅由單個(gè)菌株組成,占融合群的44.4%。對(duì)于菌絲融合群與菌株的地理來源的關(guān)系,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為核盤菌的菌絲融合群與菌株的地理來源并無明顯的相關(guān)性。本研究的結(jié)果也如此,具體表現(xiàn)為不同地區(qū)來源的菌株可能屬于同一菌絲融合群,也可能屬于不同的菌絲融合群,同一地區(qū)來源的菌株表現(xiàn)相同的結(jié)果。

許多研究已經(jīng)表明核盤菌存在致病性分化的現(xiàn)象,表現(xiàn)在不同融合群菌株的致病力會(huì)明顯不同,即使是同一融合群內(nèi)也存在致病性明顯不同的菌株,而且這種致病力分化的現(xiàn)象與菌株的地理來源無關(guān)。所以,在評(píng)價(jià)某一地區(qū)的核盤菌菌株的致病性或者進(jìn)行抗病育種篩選時(shí),要盡可能多地收集菌株,才能得到更好的結(jié)果。

草酸一直以來被認(rèn)為與核盤菌的致病性密切相關(guān),作為核盤菌重要的致病因素已引起愈來愈多的關(guān)注。Godoy等[20]發(fā)現(xiàn)核盤菌的突變體會(huì)失去合成草酸的能力,而變?yōu)榉侵虏【?當(dāng)恢復(fù)突變后,菌株會(huì)重新恢復(fù)合成草酸的能力,變?yōu)檎５木哂兄虏×Φ木?。本研究證實(shí)核盤菌融合群間致病力存在顯著差異,并與產(chǎn)生的草酸量成正相關(guān),與融合群的地理來源無相關(guān)性。同Durman等[15]和Li等[10]的研究結(jié)果一致。

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(責(zé)任編輯：田喆)

MycelialcompatibilitygroupandpathogenicityvariationofSclerotinia sclerotiorumpopulationsfromInnerMongoliaandHeilongjiang

LiuChunlai,WangShuang,XiaJixing,YangFan,LiXinmin,MengQinglin,LiuYu,SuBaohua,ZhangYunhua

(PlantProtectionInstituteofHeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086,China)

ToidentifythegeneticdiversityofSclerotinia sclerotiorum, 44isolatesfromInnerMongoliaandHeilongjiangwereascertainedbymycelialcompatibilitygroups(MCGs)screeningmethods,andthedifferencesamongMCGswereobservedbycomparingtheirdifferencesinmyceliagrowthrate,pathogenicityandproductionofoxalicacidandtotalacids.Theresultsshowedthatthe44isolatesweregroupedin25MCGs,amongwhich14MCGsconsistedofonlyoneisolate,withaproportionof56.0%.Significantdifferenceswerefoundinmyceliagrowthrate,pathogenicityandproductionofoxalicacidandtotalacidswithinandamongMCGs(P<0.001)regardlessoftheirgeographicorigins.CorrelationanalysisindicatedthatS. sclerotiorumpathogenicitywaspositivelyrelatedtooxalicacidproduction(r=0.484, P ≤0.01)andnegativelyrelatedtopH(r=-0.580, P≤0.01),butnotrelatedtothemyceliagrowthrate.TherewasanegativerelationshipbetweenpHvaluesandoxalicacidproduction(r=-0.392, P ≤0.01),suggestingthatoxalicacidproductioncontributedmosttothetotalproductionofacidsreleasedbyS. sclerotiorum.

Sclerotinia sclerotiorum;oxalicacid;pathogenicity;growthrate

20150602

20150817

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-16)

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Q935

ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.03.025