黃芪地上、地下部分化學(xué)成分以及藥效學(xué)比較

謝新然　曲婷麗　許晉芳　劉銳玲　趙正保

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黃芪地上、地下部分化學(xué)成分以及藥效學(xué)比較

謝新然曲婷麗許晉芳劉銳玲趙正?！?/p>

目的對(duì)黃芪地上部分與地下部分的藥材進(jìn)行比較，為黃芪地上部分的開(kāi)發(fā)利用提供參考。方法通過(guò)化學(xué)成分分析和藥效學(xué)研究相結(jié)合的方法，對(duì)黃芪地上、地下部分進(jìn)行全面、系統(tǒng)比較，即采用多指標(biāo)定量方法對(duì)黃芪地上、地下部分10種化學(xué)成分進(jìn)行定性、定量分析；以小鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)為指標(biāo)，對(duì)比觀察黃芪地上、地下部分水煎液對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠骨髓造血功能損傷的保護(hù)作用。結(jié)果在本研究中，黃芪地上、地下部分化學(xué)成分相似，其中黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅲ、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷地上部分含量均高于地下部分。藥效學(xué)研究結(jié)果表明，黃芪地上、地下部分均能升高受損小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白數(shù)量，藥效沒(méi)有明顯差異，用藥期間各組小鼠未見(jiàn)有明顯的不良作用。結(jié)論黃芪地上部分具有一定的利用價(jià)值，可對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

黃芪；黃芪地上部分；化學(xué)成分；藥效學(xué)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hisao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.干燥根[1]。其味甘，性微溫，具補(bǔ)氣固表，利尿托毒，排膿，斂瘡生肌之功效[2]。黃芪是一種常用的大宗傳統(tǒng)中藥材，伴隨對(duì)其認(rèn)識(shí)的不斷深入，黃芪用量逐年增加，除供藥用外，還廣泛用于保健品、飲料、化妝品等工業(yè)中，這給藥用黃芪植物資源帶來(lái)一定壓力，因此人們對(duì)其地上部分進(jìn)行了相關(guān)研究。其研究的工作主要有：黃芪地下部分與地上部分氨基酸類、總皂苷、總黃酮、總多糖、黃芪甲苷、微量元素等含量的比較[3～6]。而關(guān)于黃芪地下部分與地上部分多種有效成分以及藥效方面的比較鮮有報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)成分分析和藥效學(xué)研究相結(jié)合的方法，對(duì)黃芪地上部分與地下部分進(jìn)行全面比較，即采用多指標(biāo)定量分析方法對(duì)其所含化學(xué)成分進(jìn)行定性、定量分析；采用對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠骨髓造血功能損傷的保護(hù)作用進(jìn)行藥效活性比較，以期為黃芪地上部分的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1主要儀器試劑AL104型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、HEMAVET 950FS 動(dòng)物血細(xì)胞分析儀(山東卓越科學(xué)儀器有限公司)、RE-6000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海安銳自動(dòng)化儀表有限公司)、SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司) 、Waters e2695高壓泵、Chromachem ELSD檢測(cè)器、Waters 2689紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、Empower色譜工作站；對(duì)照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅳ均購(gòu)于上海永恒生物科技有限公司，批號(hào)依次為20120428，20120528，20120515，20100202，20111125，20110503；芒柄花苷、毛蕊異黃酮購(gòu)于成都曼斯特公司，Lot號(hào)依次為：13021808，13082713；3-羥基-9,10-二甲基紫檀烷、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷購(gòu)于江蘇永健醫(yī)藥科技公司，批號(hào)分別為YJ150718，YJ150717，純度均大于98%。乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher公司)；生理鹽水(安徽雙鶴藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：140222)、環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：04141102 規(guī)格：0.2 g)；水為純凈水、其余試劑均為分析純。

藥材產(chǎn)地為山西省渾源縣，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)白云娥教授鑒定，為豆科植物蒙古黃芪的干燥根及地上部分。

1.2動(dòng)物昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：scxk(晉) 2009-0001。動(dòng)物顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1含量測(cè)定

2.1.1色譜條件[7]流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，體積流量 1.0 ml·min-1，蒸發(fā)光檢測(cè)器參數(shù)：N2壓力為23 psi，霧化溫度為35 ℃，汽化溫度為50 ℃，增益值為5.0, Venusil MP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 (m)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫：0～8 min，20%A；8～15 min，30%A；15～30 min，43%A；30～40 min，60%A；40～50 min，100%A；50～60 min，100%A。

2.1.2混合對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷、黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷I對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為960.0，640.0，640.0，560.0，960.0，960.0，960.0，960.0，640.0，960.0 μg·ml-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別量取適量置25 ml容量瓶中，以甲醇定容至刻度，制成濃度分別為200.0，80.0，30.0，12.0，140.0，60.0，60.0，40.0，50.0，160.0 μg·ml-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備分別取黃芪地下、地上部分粉末8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇320 ml，超聲處理40 min，濾過(guò)，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過(guò)程中，將以上配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液分別逐級(jí)稀釋。過(guò)0.45 μm濾膜后，進(jìn)樣20 μl，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.5含量測(cè)定將對(duì)照品溶液與適宜濃度的供試品溶液分別進(jìn)樣20 μl，進(jìn)行含量測(cè)定。

2.2藥效學(xué)比較

2.2.1實(shí)驗(yàn)樣品的制備取黃芪地下及地上部分，蒸餾水浸泡30 min，加水煎煮2次，第1次加8倍量水，第2次加6倍量水，每次煎煮40 min。合并兩次煎出液，過(guò)濾，濾液加熱濃縮使藥物濃度為3.12 g·ml-1，將制備的藥液放入4 ℃冰箱保存，備用。

2.2.2動(dòng)物分組及給藥將動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為六組，每組10只，即正常組、模型組、黃芪地下部分組、黃芪地上部分低劑量組、黃芪地上部分中劑量組、黃芪地上部分高劑量組。正常組、模型組每24 h灌胃給予蒸餾水一次；黃芪地下部分組每24 h灌胃給予黃芪地下部分水煎液，給藥劑量15.6 g·kg-1；黃芪地上部分低、中、高組給藥劑量分別為15.6,31.2,62.4 g·kg-1，24 h灌胃給藥1次；連續(xù)給藥15 d。

2.2.3動(dòng)物造模除正常組外，其余各組分別于給藥第12，13，14天，均腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg·kg-1體質(zhì)量(0.1 g·l-1)，1次/天，共注射3次。正常組注射等容量生理鹽水。

2.2.4一般狀態(tài)觀察與療效評(píng)價(jià)每天觀察并記錄各實(shí)驗(yàn)組小鼠的精神狀態(tài)、皮毛光澤、自主活動(dòng)、體質(zhì)量變化及死亡情況。各組末次給藥或給生理鹽水后24 h，動(dòng)物摘眼球取血，測(cè)各組動(dòng)物白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)及血紅蛋白數(shù)。

2.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果選用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，利用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間值，當(dāng)P<0.05時(shí)，提示實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1含量測(cè)定文獻(xiàn)資料報(bào)道：黃酮和皂苷類成分是黃芪中主要的藥效成分，所以實(shí)驗(yàn)選用4個(gè)皂苷類成分(黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ)和6個(gè)黃酮類成分(毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷)對(duì)黃芪地上、地下部分中的有效成分進(jìn)行比較。

對(duì)于6種黃酮類成分，橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量(X)，縱坐標(biāo)為峰面積(Y)，對(duì)于4種皂苷成分，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)(x)為橫坐標(biāo)，峰面積的對(duì)數(shù)(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及其線性范圍(見(jiàn)表1)。經(jīng)方法學(xué)考察，所建立的含量測(cè)定條件其穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度、回收率等均符合規(guī)定，可用于黃芪中化學(xué)成分的含量測(cè)定。

對(duì)黃芪地上、地下部分中的有效成分進(jìn)行比較(見(jiàn)表2，圖1)，結(jié)果顯示，黃芪地上、地下部分成分相似，其中黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅲ、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷地上部分含量均高于地下部分。其中，地上部分黃芪皂苷Ⅲ的含量為地下部分的20倍，毛蕊異黃酮含量為地下部分的4倍，芒柄花苷含量為地下部分的2倍。地上部分與地下部分的皂苷類與黃酮類含量相當(dāng)成分相當(dāng)。

表1　線性回歸分析

表2　黃芪地上、地下部分十種成分含量的比較

續(xù)表

圖1　地上部分與地下部分皂苷類成分(Ⅰ)、黃酮類成分(Ⅱ)的比較

3.2藥效學(xué)比較

3.2.1對(duì)小鼠一般特征的影響造模第4、5天，各組小鼠精神萎靡，活動(dòng)減少，聚堆，蜷臥，嗜睡，飲食減少，毛色失去光澤，皮膚呈現(xiàn)不同程度蒼白，尾色蒼白，皮毛粗亂、蓬松且無(wú)光澤，其中模型組表現(xiàn)最明顯，給藥組小鼠逐漸恢復(fù)。

3.2.2對(duì)小鼠白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白的影響連續(xù)3 d腹腔注射環(huán)磷酰胺100 g·L-1，2 d后小鼠白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量顯著減少，提示造模成功。黃芪和黃芪地上部分水煎液給藥組小鼠連續(xù)灌胃給藥11 d無(wú)明顯異?，F(xiàn)象，動(dòng)物活動(dòng)、食量、排泄物等均無(wú)異常，體質(zhì)量平穩(wěn)增加。與模型組比較，黃芪地下部分水提液組及黃芪地上部分水提液各劑量組的白細(xì)胞、紅細(xì)胞數(shù)均能明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，黃芪地下部分水提液組與黃芪地上部分水提液高劑量組可明顯提高小鼠的血紅蛋白數(shù)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示黃芪地上部分水提液對(duì)環(huán)磷酰胺所致的小鼠骨髓造血損傷具有一定的保護(hù)作用(見(jiàn)表3)。

表3　藥物對(duì)各模型小組白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量的影響

4　討論

4.1黃芪地上部分與地下部分的藥材化學(xué)成分比較黃芪中主要有黃酮類、皂苷類、多糖、氨基酸、微量元素等化學(xué)成分，其中黃酮類化合物有黃酮、異黃酮、異黃烷和紫檀烷四大類；皂苷類化合物有黃芪皂苷及大豆皂苷[8]。黃芪地上部分與地下部分化學(xué)成分比較試驗(yàn)結(jié)果顯示，所測(cè)定的10種成分只是量上的差異，其中黃芪皂苷Ⅳ、黃芪皂苷Ⅲ、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、7,2′-二羥基-3′,4′-二甲氧基異黃烷地上部分含量均高于地下部分。同時(shí)，黃芪地上部分總皂苷、總黃酮含量均較高。文獻(xiàn)報(bào)道，黃芪皂苷類及黃酮類成分均具有較好的藥理作用，其中黃芪皂苷類成分具有抗衰老、抗病毒、抗風(fēng)濕、抗腫瘤[9]以及很好的抗氧化活性[10]，尤其對(duì)心血管系統(tǒng)具有重要作用[11]；黃芪黃酮類成分具有抗腫瘤、抗損傷、抗突變和抑制動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)效應(yīng)[12]。鑒于黃芪皂苷類及黃酮類組分藥理作用顯著，因此可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用黃芪地上部分有效部位，對(duì)黃芪地上部分進(jìn)行綜合開(kāi)發(fā)利用。

4.2黃芪地上部分與地下部分藥效學(xué)比較抗癌藥環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,Cy) 是臨床上廣泛應(yīng)用的烷化劑類化療藥物之一，在臨床治療疾病過(guò)程中，環(huán)磷酰胺不但對(duì)癌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞起到了殺傷和抑制作用，亦能對(duì)機(jī)體的正常細(xì)胞，尤其是骨髓造血干細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，形成造血、免疫系統(tǒng)雙重抑制[13]。黃芪是臨床防治化療后骨髓抑制的常用中藥，對(duì)骨髓抑制引起的三系血細(xì)胞減少均有一定防治作用[14]。本研究采用環(huán)磷酰胺復(fù)制骨髓抑制模型，從藥效結(jié)果可以看出，黃芪地上部分及地下部分水提液對(duì)環(huán)磷酰胺所致的小鼠骨髓損傷均具有一定的保護(hù)作用，在提高受損小鼠白細(xì)胞與紅細(xì)胞數(shù)量方面，二者沒(méi)有明顯差異，高劑量地上部分水煎液在提高小鼠血紅蛋白方面，與地下部分沒(méi)有明顯差異。因此，黃芪地上部分是可以考慮藥用的，但還需按照新藥標(biāo)準(zhǔn)做深入的研究。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)黃芪地上部分與地下部分在小鼠骨髓損傷保護(hù)作用方面的功效進(jìn)行了比較，由于黃芪具有多方面的藥理活性，今后可采用更為廣泛的藥理活性指標(biāo)對(duì)兩者進(jìn)行深入對(duì)比研究。

4.3展望黃芪是我國(guó)重要的傳統(tǒng)藥材，已經(jīng)被列入國(guó)家重點(diǎn)中藥材，其獨(dú)特的藥用功效使得黃芪供不應(yīng)求。其入藥部位為根，而地上部分開(kāi)發(fā)嚴(yán)重滯后，長(zhǎng)期以來(lái)少量作為牲畜的草料，大量則自然干枯或收集焚燒。通過(guò)對(duì)黃芪地上部分與地下部分的藥材化學(xué)成分和藥效學(xué)的比較可以看出，黃芪地上部分雖然所含有效成分含量與地下部分不完全一致，但它在對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠骨髓造血功能損傷的保護(hù)作用方面與地下部分沒(méi)有明顯差別，在一定劑量及條件下，黃芪地上部分可以作為藥材替代地下部分，但是仍需要繼續(xù)深入的探索與研究。

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Comparison of the Chemical Constituents and Pharmacological Activities between the Overground Parts and the Underground Parts of theAstragalusMembranaceus

XIE XinranQU TingliXU JinfangLIU RuilingZHAO Zhengbao△

(School of Pharmaceutical Science, Shanxi Medical University, Shanxi, Taiyuan 030001, China)

ObjectiveTo provide a reference for the development and utilization of the overground parts ofAstragalusmembranaceusby carrying out comparison between the overground parts and the underground parts ofAstragalusmembranaceus. MethodsThe comparison of the difference between the overground parts and underground parts ofAstragalusmembranaceuswas conducted in the aspects of chemical constitutions and pharmacological activities. 10 kinds of their chemical constituents were analyzed by muti-components determination, and their effects on marrow hematopoietic function in mice caused by cyclophosphamide damage were evaluated with blood counts as an index. ResultThe chemical composition in the overground and underground parts ofAstragalusmembranaceuswere similar, but the content of astragaloside Ⅳ, astragaloside Ⅲ, ononin, calycosin, formononetin, 7,2′-dihydroxy-3′,4′-dimethoxy isoflavans were higher in the overground parts than those in the underground parts. The pharmacological effect of the two parts had no significant difference, which can increase the number of white blood cells, red blood cells and hemoglobin of the damaged mice without any apparent side effect. ConclusionThe overgrond parts ofAstragalusmembranaceuswere valuable for further exploration.

Astragalusmembranaceus; Overground parts; Chemical composition; Pharmacodynamics

山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室(太原 030001)

△

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.15.022

1003-8914(2016)-15-2188-05

(本文校對(duì)：畢小平2015-11-27)