熒光定量PCR檢測(cè)食品中沙門氏菌研究

□ 魏昭 梁勃 吳蕊 孫琛 王權(quán) 衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

熒光定量PCR檢測(cè)食品中沙門氏菌研究

□ 魏昭 梁勃 吳蕊 孫琛 王權(quán) 衡水市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（FQ-PCR）實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，可對(duì)目標(biāo)DNA分子起始拷貝數(shù)精確定量。因其檢測(cè)方法精確、靈敏、污染途徑少，已成為國(guó)際公認(rèn)的核酸分子定量的標(biāo)準(zhǔn)方法，在食品中安全微生物的鑒定也有重要應(yīng)用［1］。沙門氏菌是引起食物中毒最為常見的致病菌，因此，建立食品中沙門氏菌中熒光定量PCR檢測(cè)方法有重要的研究意義。材料與方法 1菌株：鼠傷寒沙門氏菌（C77-31）有中科院微生物所提供，肉類、奶制品等產(chǎn)品均購(gòu)于農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)。2主要試劑和設(shè)備：DNA提取試劑購(gòu)買于美國(guó)Invitrogen公司；Taq酶和緩沖液購(gòu)買于日本TaKara；opction2熒光定量PCR購(gòu)買于美國(guó)MJ公司；超速離心機(jī)購(gòu)買于Eppendorf；細(xì)菌鑒定儀；所用的常規(guī)試劑均為分析純，購(gòu)買于國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；方法，將標(biāo)準(zhǔn)菌株在XLD、三糖鐵斜面和肉湯培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從肉湯培養(yǎng)基中取一定量的菌液裝入EP管中，離心，去上清，加入雙蒸水，沸水浴、冰水浴，離心，取上清。食品樣品采用沙門氏菌國(guó)標(biāo)檢測(cè)法（GB 4789.4-2010）中BPW前增菌之后的培養(yǎng)液裝入EP管中，進(jìn)行相同的操作。引物探針設(shè)計(jì)，在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對(duì)象，然后用PrimerPremier5搜索引物和用Oligo驗(yàn)證評(píng)估引物。經(jīng)過篩選進(jìn)行特異性和靈敏度的實(shí)驗(yàn)。

表1　引物和探針序列

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

分別考察了不同Taq酶用量，Mg2+濃度、引物濃度和探針濃度對(duì)所提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的影響。同時(shí)對(duì)循環(huán)條件也進(jìn)行了優(yōu)化。靈敏度實(shí)驗(yàn)，將沙門氏菌按照上述的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)量OD后估算菌數(shù)，然后稀釋、涂板確定菌密度，然后用熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。

特異性實(shí)驗(yàn)，將沙門氏菌與其他的食品致病菌共同進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，做陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)并用國(guó)標(biāo)法進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)果與分析

反應(yīng)體系的優(yōu)化 1Taq酶的優(yōu)化，考察了不同的酶量（0.5至2.5U，每個(gè)梯度為0.5）對(duì)陽(yáng)性模板的Ct值的影響，陽(yáng)性模板Ct值為23.1-23.95之間變化，其影響并不大，當(dāng)酶量為2.5U時(shí)，整個(gè)反應(yīng)體系的熒光量最高。2Mg2+濃度的有優(yōu)化，從表2中可以看出，不同的Mg2+濃度對(duì)陽(yáng)性模板的Ct的影響并不大，當(dāng)酶量為3.5U時(shí)，整個(gè)反應(yīng)體系的熒光量最高，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)也選用該濃度作為最佳濃度。

表2　Mg2+濃度對(duì)陽(yáng)性模板的Ct值的影響

3引物探針量的優(yōu)化，分別選擇了引物濃度0.25，0.5，0.75和1.0μmol/L，探針的濃度分別為0.125，0.5，0.75 和1.0μmol/L，并以不同的濃度的引物和探針濃度配比，對(duì)提取的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。研究結(jié)果表明當(dāng)引物濃度為0.75μmol/L，探針濃度為0.5μmol/L時(shí)熒光效率最高，因此，該濃度作為最佳條件。4循環(huán)條件的優(yōu)化，在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈。退火是PCR的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。實(shí)際上，引物延伸在退火時(shí)即已開始，因?yàn)門aqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃，延伸反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度［3］。從表4中可以看出延伸時(shí)溫度為60℃較好。

表3　循環(huán)條件的優(yōu)化

特異性檢測(cè)

對(duì)50份食品分別按照熒光定量PCR、國(guó)標(biāo)法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，熒光定量PCR的陽(yáng)性數(shù)為9，國(guó)標(biāo)法為8，其陽(yáng)性率分別為18%和16%。雖然兩種方法的差異并不顯著，但是熒光定量PCR檢出數(shù)相對(duì)偏高，檢測(cè)時(shí)間上大大降低。這是由于熒光定量PCR使用特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別，具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí)，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽(yáng)性低。靈敏度檢測(cè)，熒光PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯象技術(shù)為一體的技術(shù)，因此它的檢測(cè)靈敏度很高。按Ct值不大于35.0判斷為陽(yáng)性，建立的方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)100CFU/ml。

表4　各濃度熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)熒光定量PCR的反應(yīng)條件和循環(huán)體系條件進(jìn)行優(yōu)化，本研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法特異性和靈敏度都較高，克服了普通PCR的缺點(diǎn)，為食品中致病微生物的定量研究提供了理論和實(shí)踐的借鑒意義。