瞿　奇，何小亮，張?jiān)讫垼酢±?，張秀萍?.廣州市第六中學(xué)，廣東510300；.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣東廣州510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心，廣東廣州510515）

·論著·

雷帕霉素對帕金森病小鼠神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的研究*

瞿奇1#，何小亮2#，張?jiān)讫?，王坤1△，張秀萍3△
（1.廣州市第六中學(xué)，廣東510300；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣東廣州510515；3.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)管理中心，廣東廣州510515）

目的研究雷帕霉素對帕金森?。≒D）小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。方法采用懸掛試驗(yàn)和爬桿試驗(yàn)檢測雷帕霉素對PD小鼠運(yùn)動行為障礙的改善作用，免疫組織化學(xué)檢測雷帕霉素對PD小鼠黑質(zhì)酪氨酸羥化酶、α-突觸核蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果雷帕霉素明顯改善了PD小鼠運(yùn)動行為缺陷，提高了酪氨酸羥化酶的表達(dá)，降低了α-突觸核蛋白的表達(dá)。結(jié)論雷帕霉素對PD小鼠具有明顯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。

帕金森??；多巴胺；神經(jīng)元；突觸蛋白類；西羅莫司

帕金森?。≒arkinson′s disease，PD）是一種中老年常見神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床癥狀主要以靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌張力增高和姿勢平衡障礙為主，目前，PD病因仍不甚明確。尋找針對PD新的治療靶點(diǎn)和有效藥物對改善PD患者生活質(zhì)量具有重要意義。雷帕霉素（西羅莫司）是從鏈球菌中提取的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，具有免疫抑制作用。有研究表明，雷帕霉素可促進(jìn)阿爾茲海默病模型中淀粉樣蛋白的清除，顯示了該藥具有明顯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)［1-5］。雷帕霉素是否可改善PD小鼠運(yùn)動行為障礙及提高酪氨酸羥化酶的表達(dá)，從而對黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)是本研究的關(guān)鍵所在。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物24只雄性C57BL小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2主要試劑1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）購自美國Sigma-Aldrich公司，抗酪氨酸抗體購自美國Millipore公司，α-突觸核蛋白購自美國Santa Cruz生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3主要儀器冰凍切片機(jī)（德國Leica公司）、倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1PD模型制備及雷帕霉素治療參照文獻(xiàn)［6-7］的方法腹腔注射MPTP制備PD小鼠模型，同時應(yīng)用雷帕霉素進(jìn)行治療。將24只（每只體質(zhì)量25 g）C57BL小鼠分為治療組、對照組、雷帕霉素組和PD組，每組6只。治療組注射 MPTP及雷帕霉素，給藥方法：注射MPTP前2 d（第1～2天）注射雷帕霉素5 mg/（kg·d），每天1次，共2 d；然后同時給予MPTP、雷帕霉素5 d（第3～7天），上午9：00注射MPTP 30 mg/kg，晚上21：00注射雷帕霉素5 mg/（kg·d）；注射MPTP 5 d后繼續(xù)單獨(dú)注射雷帕霉素5mg/（kg·d）4 d（第8～11天），每天1次。對照組第1～2天及第8～11天注射生理鹽水0.1 mL/10 g，每天1次，第3～7天上午9：00和晚上21：00注射生理鹽水0.1 mL/10 g，各1次。雷帕霉素組：第1～2天及第8～11天每天注射雷帕霉素1次（劑量與治療組相同），第3～7天上午9：00注射生理鹽水（劑量與對照組相同），晚上21：00注射雷帕霉素。PD組：第1～2天及第8～11天每天注射生理鹽水1次（劑量與對照組相同），第3～7天上午9：00注射MPTP（劑量與治療組相同），晚上21：00注射生理鹽水。末次注射1 d后于大腦不同部位取材進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2行為學(xué)試驗(yàn)

1.2.2.1爬桿試驗(yàn)將一直徑為2 cm的泡沫塑料小球固定于一根長50 cm、粗1 cm的木桿頂端，木桿上纏2層紗布以防打滑。持小鼠尾部將其頭向下置于竿頂（以小鼠雙后肢置于球上為準(zhǔn)），讓其自然爬下，小鼠自站于竿頂至雙前肢接觸竿底平臺為爬完全長。在造模后各組分別取一定數(shù)量小鼠進(jìn)行爬桿試驗(yàn)，觀察小鼠行為學(xué)改變，記錄爬竿時間。

1.2.2.2懸掛試驗(yàn)自制有機(jī)玻璃試驗(yàn)箱，水平放置的金屬桿直徑1.5 mm，距地面30 cm，金屬桿上方1 cm加蓋，以避免小鼠翻坐于金屬桿上，試驗(yàn)中小鼠懸掛于金屬桿上，記錄落地前時間。每次檢測間隔時間為1 min，共檢測5次，取平均值。

1.2.3免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色將小鼠深度麻醉后快速取腦，固定過夜。-25℃用冰凍切片機(jī)切成10 μm厚腦片，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）漂洗3次，每次5 min，封閉液（PBS、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚、5%牛血清清蛋白）室溫孵育15 min后加入一抗。一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h，二氨基聯(lián)苯氨染色，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析（One Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1四組小鼠懸掛試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)結(jié)果比較PD組小鼠出現(xiàn)立毛、震顫等癥狀，治療組小鼠運(yùn)動行為缺陷明顯改善，懸掛時間明顯延長（圖1A），爬到桿底所用時間明顯縮短（圖1B），與PD組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

圖1　四組小鼠懸掛試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)結(jié)果比較

2.2四組小鼠腦組織酪氨酸羥化酶表達(dá)水平比較治療組小鼠腦組織酪氨酸羥化酶表達(dá)水平較PD組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2　四組小鼠腦組織酪氨酸羥化酶表達(dá)水平比較（免疫組化，50×）

2.3四組小鼠腦組織α-突觸核蛋白表達(dá)水平比較治療組小鼠腦組織α-突觸核蛋白表達(dá)水平較PD組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3　四組小鼠腦組織α-突觸核蛋白表達(dá)水平比較（免疫組化，400×）

3　討　論

PD是僅次于阿爾茲海默病的中老年常見神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，據(jù)流行病學(xué)資料顯示，我國目前PD患者約200萬，約占世界PD患者總數(shù)的2/5，我國每年新增PD患者近10萬人，65歲以上人群患病率為1.67%［8］。隨著我國人口老齡化的到來，PD發(fā)病率逐年遞增，加之該病起病緩慢，病程較長，晚期常出現(xiàn)肢體僵硬，同時伴高級神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，如癡呆、抑郁等，甚至喪失生活自理能力，嚴(yán)重影響患者身心健康，給社會和患者家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)。根據(jù)PD發(fā)病機(jī)制，延緩黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性和補(bǔ)充多巴胺是治療PD的基本原則，基于此，目前，左旋多巴仍然是治療PD的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其可通過血腦屏障，在多巴胺脫羧酶作用下變?yōu)槎喟桶?，發(fā)揮替代療法的作用。在疾病初期具有明顯緩解作用，但長期服用易出現(xiàn)直立性低血壓、心律失常，且易出現(xiàn)譫妄、幻覺等精神癥狀，嚴(yán)重時出現(xiàn)異動癥、劑末惡化現(xiàn)象、“開-關(guān)”現(xiàn)象等并發(fā)癥［9］。顱內(nèi)手術(shù)，如蒼白球切開術(shù)及下丘腦電刺激能減輕一些PD癥狀，神經(jīng)干細(xì)胞移植可通過細(xì)胞增殖、分化與整合替代多巴胺神經(jīng)元［10-12］。然而上述治療方法無一能改變黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)變性的進(jìn)程，因而加強(qiáng)PD的病因?qū)W研究、發(fā)現(xiàn)研制PD治療新藥的有效靶標(biāo)對提高人類健康水平具有重大意義。

雷帕霉素通過抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路調(diào)節(jié)機(jī)體自噬、新陳代謝等。有研究表明，雷帕霉素通過有效抑制白介素-2對T、B淋巴細(xì)胞的激活，使細(xì)胞停滯在G1期，有效減輕炎性反應(yīng)［13］。哺乳動物mTOR通路廣泛存在于機(jī)體細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，主要功能是依據(jù)細(xì)胞營養(yǎng)狀態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及分化，且對細(xì)胞自噬、新陳代謝及核糖體形成等均具有調(diào)控作用［14-16］。因此，雷帕霉素可通過多種途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。近來年有研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能延長小鼠壽命，且阿爾茲海默病動物模型的研究結(jié)果表明，雷帕霉素能改善阿爾茲海默病小鼠的認(rèn)知，減少淀粉蛋白的聚集，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［1-5］。本研究對雷帕霉素在PD中的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，注射雷帕霉素后能明顯改善注射MPTP導(dǎo)致的小鼠立毛、震顫等表現(xiàn)，同時通過行為學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能延長PD小鼠懸掛時間，縮短PD小鼠爬桿時間，說明雷帕霉素能明顯改善PD小鼠運(yùn)動行為障礙（圖1）。

多巴胺神經(jīng)元凋亡是PD主要的發(fā)病機(jī)制，Malagelada等［17］提出，雷帕霉素可通過下游真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1及絲氨酸/蘇氨酸激酶通路抑制低氧誘導(dǎo)因子1反應(yīng)基因蛋白的翻譯，同時通過促進(jìn)蛋白激酶B第308位點(diǎn)上的蘇氨酸殘基磷酸化，減少神經(jīng)元凋亡。本研究通過采用免疫組化檢測小鼠腦組織酪氨酸羥化酶的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能提高中腦黑質(zhì)酪氨酸羥化酶的表達(dá)，從而對多巴胺神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。作者推測，雷帕霉素可能通過mTOR通路，促進(jìn)與細(xì)胞生存密切相關(guān)的蛋白激酶B通路的激活，進(jìn)而對多巴胺神經(jīng)元發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)（圖2）。

PD的主要病理改變是α-突觸核蛋白的聚集，本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能明顯降低中腦黑質(zhì)突觸核蛋白的聚集（圖3）。有研究表明，雷帕霉素通過直接抑制其下游信號通路mTORC1的功能，促進(jìn)細(xì)胞自噬功能，減輕氧自由基的損傷［18-19］。作者推測，雷帕霉素在PD中可能通過促進(jìn)細(xì)胞自噬功能，加強(qiáng)細(xì)胞對突觸核蛋白的清除，從而減輕突觸核蛋白對神經(jīng)元的毒性作用，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。關(guān)于雷帕霉素對PD小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素明顯改善了PD小鼠運(yùn)動行為缺陷，提高了PD小鼠酪氨酸羥化酶的表達(dá)，降低了PD小鼠α-突觸核蛋白的表達(dá)，表明雷帕霉素對PD小鼠具有明顯神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，可能成為治療PD的一種新型藥物。

［1］Maiese K，Chong ZZ，Shang YC，et al.mTOR：on target for novel therapeutic strategies in the nervous system［J］.Trends Mol Med，2013，19（1）：51-60.

［2］Maiese K.Taking aim at Alzheimer′s disease through the mammalian target of rapamycin［J］.Ann Med，2014，46（8）：587-596.

［3］Maiese K.Driving neural regeneration through the mammalian target of rapamycin［J］.Neural Regen Res，2014，19（15）：1413-1417.

［4］Heras-Sandoval D，Pérez-Rojas JM，Hernández-Damián J，et al.The role of PI3K/AKT/mTOR pathway in the modulation of autophagy and the clearance of protein aggregates in neurodegeneration［J］.Cell Signal，2014，26（12）：2694-2701.

［5］Xue Z，Guo Y，Zhang S，et al.Beta-asarone attenuates amyloid beta-induced autophagy via Akt/mTOR pathway in PC12 cells［J］.Eur J Pharmacol，2014，741：195-204.

［6］Dehay B，Bové J，Rodríguez-Muela N，et al.Pathogenic lysosomal depletion in Parkinson′s disease［J］.J Neurosci，2010，30（37）：12535-12544.

［7］Blandini F，Armentero MT.Animal models of Parkinson′s disease［J］. FEBS J，2012，279（7）：1156-1166.

［8］Chen W，Chen S，Xiao Q，et al.Current clinical practice for Parkinson′s disease among Chinese physicians，general neurologists and movement disorders specialists：a national survey［J］.BMC Neurol，2012，12：155.

［9］Olanow CW.Levodopa：effect on cell death and the natural history of Parkinson′s disease［J］.Mov Disord，2015，30（1）：37-44.

［10］Perestelo-Pérez L，Rivero-Santana A，Pérez-Ramos J，et al.Deep brain stimulation in Parkinson′s disease：meta-analysis of randomized controlled trials［J］.J Neurol，2014，261（11）：2051-2060.

［11］Müller J，Ossig C，Greiner JF，et al.Intrastriatal transplantation of adult human neural crest-derived stem cells improves functional outcome in parkinsonian rats［J］.Stem Cells Transl Med，2015，4（1）：31-43.

［12］Wu J，Sheng C，Liu Z，et al.Lmx1a enhances the effect of iNSCs in a PD model［J］.Stem Cel Res，2015，14（1）：1-9.

［13］Chapman NM，Chi H.mTOR Links Environmental Signals to T Cell Fate Decisions［J］.Front Immunol，2015，5：686.

［14］Kim YC，Guan KL.mTOR：a pharmacologic target for autophagy regulation［J］.J Clin Invest，2015，125（1）：25-32.

［15］Morita M，Gravel SP，Hulea L，et al.mTOR coordinates protein synthesis，mitochondrial activity and proliferation［J］.Cell Cycle，2015，14（4）：473-480.

［16］Cargnello M，Tcherkezian J，Roux PP.The expanding role of mTOR in cancer cell growth and proliferation［J］.Mutagenesis，2015，30（2）：169-176.

［17］Malagelada C，Jin ZH，Jackson-Lewis V，et al.Rapamycin protects against neuron death in in vitro and in vivo models of Parkinson′s disease［J］.J Neurosci，2010，30（3）：1166-1175.

［18］Sasazawa Y，Sato N，Umezawa K，et al.Conophylline protects cells in cellular models of neurodegenerative diseases by inducing mammalian target of rapamycin（mTOR）-independent autophagy［J］.J Biol Chem，2015，290（10）：6168-6178.

［19］Li Y，Chen C，Yao F，et al.AMPK inhibits cardiac hypertrophy by promoting autophagy via mTORC1［J］.Arch Biochem Biophys，2014，558：79-86.

Research on neuroprotective effects of rapamycin in Parkinson′s disease mice*

Qu Qi1#，He Xiaoliang2#，Zhang Yunlong2，Wang Kun1△，Zhang Xiuping3△（1.Guangzhou Municipal No.6 Middle School，Guangzhou，Guangdong 510300，China；2.Teaching and Researching Section of Immunology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China；3.Teaching Center of Experimental Teaching Management，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China）

ObjectiveTo study the neuroprotective effects of rapamycin in Parkinson′s disease（PD）mice.MethodsThe suspension test and the pole-climbing test were adopted to detect the improvement effect of rapamycin on the movement disorder of PD mice.The expression of tyrosine hydroxylase and α-synuclein in the substantia nigra of PD mice were examined via immunohistochemistry.ResultsRapamycin significantly improved the movement disorder of PD mice，increased the expression of tyrosine hydroxylase and decreased the expression of α-synuclein in the PD mice.ConclusionRapamycin has the obvious neuroprotective effects in PD mice.

Parkinson disease；Dopamine；Neurons；Synapsins；Sirolimus

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.001

A

1009-5519（2016）06-0801-03

廣東省科技計劃項(xiàng)目（2013B021800305）；廣州市科技計劃項(xiàng)目（2014J4100008）。

瞿奇（1997-），在讀高中生，主要從事帕金森動物模型制備及動物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究；何小亮（1987-），在讀碩士研究生，主要從事免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

#共同第一作者。

△張秀萍，E-mail：spz9528@163.com；王坤，E-mail：281146423@qq.com。

（2016-01-26）