桑椹提取物與葉黃素聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜光損傷小鼠抗氧化能力的影響

陳春艷，錢彩虹

(湖北生物科技職業(yè)學(xué)院，武漢　430070)

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桑椹提取物與葉黃素聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜光損傷小鼠抗氧化能力的影響

陳春艷，錢彩虹

(湖北生物科技職業(yè)學(xué)院，武漢430070)

目的：評價桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)對光損傷視網(wǎng)膜的抗氧化能力。方法：75只小鼠分為正常對照組、模型對照組和低、中、高劑量給藥組，采用自制光照箱進(jìn)行造模，檢測視網(wǎng)膜組織的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)活力以及丙二醛(MDA)含量。結(jié)果：光照導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-Px、CAT和T-AOC活力顯著下降，MDA含量顯著增加，攝入低、中、高劑量受試物后，與模型對照組相比，SOD活力分別增加24.0%、50.4%和77.3%、GSH-Px活力分別增加13.9%、38.0%和56.5%、CAT活力分別增加26%、69.1%和93.5%、T-AOC活力分別增加15.4%、38.5%和46.2%、MDA含量分別降低20.0%、35.6%和47.2%，其中中、高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜光損傷小鼠具有抗氧化作用。

桑椹提取物；葉黃素；視網(wǎng)膜光損傷；抗氧化能力

視網(wǎng)膜容易受到強(qiáng)光的影響而造成視覺功能障礙、光誘導(dǎo)視網(wǎng)膜損傷等，從而造成細(xì)胞一系列損傷、凋亡、生物膜溶解和細(xì)胞壞死，導(dǎo)致感光細(xì)胞的凋亡和視網(wǎng)膜變性[1]。環(huán)境和人造光源都是視網(wǎng)膜損傷的潛在威脅[2，3]，因此研究篩選具有保護(hù)視網(wǎng)膜光損傷的活性成分具有非常重要的意義。氧化損傷是光導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷的機(jī)制之一，感光細(xì)胞外節(jié)盤膜中含有高水平的長鏈多不飽和脂肪酸，其對感光細(xì)胞具有保護(hù)作用，但易于氧化，慢性持續(xù)的光損傷會使眼內(nèi)自由基的濃度增加，產(chǎn)生單線態(tài)氧、過氧化氫及羥基自由基等一系列自由基，作用于長鏈多不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，破壞細(xì)胞膜的完整性、流動性，嚴(yán)重影響細(xì)胞功能[4-7]。桑椹是?？粕僦参锍墒旃氲慕y(tǒng)稱，我國桑椹資源非常豐富，除青藏高原外，全國各地均有栽培。桑椹提取物中富含黃酮、糖類及生物堿等多種生物活性成分，其中桑椹多糖提取物具有顯著的清除自由基作用[8，9]；葉黃素可與細(xì)胞膜上的脂類結(jié)合，有效地抑制脂類的氧化反應(yīng)，減輕氧化產(chǎn)物對視網(wǎng)膜的毒害[10，11]。葉黃素與桑椹提取物聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用還未見報道。本文以視網(wǎng)膜光損傷小鼠模型為研究對象，研究桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)對氧化損傷的保護(hù)作用，為具有緩解視疲勞功能食品的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

復(fù)方托吡卡胺滴眼液，沈陽興齊眼藥股份有限公司；氯霉素滴眼液，沈陽神龍藥業(yè)有限公司；SOD、MDA、CAT、GSH-PX和T-AOC檢測試劑盒，南京建成公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天公司；桑椹，市售；5%葉黃素，DSM公司。

1.2儀器與設(shè)備

SpectraMaxM2e酶標(biāo)儀，美國Molecular公司；TES-1332A照度計，泰仕電子工業(yè)股份有限公司；DY89-Ⅱ型電動玻璃均漿機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；白色熒光燈(85W)，中山市重誠照明電器有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動物

健康成年昆明小鼠75只，購于湖北省疾病預(yù)防控制中心，雌雄不限，體重約25～32g，經(jīng)前節(jié)及眼底檢查無眼部疾病。動物房內(nèi)通風(fēng)良好，自然晝夜光線照明。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1動物分組和造模給藥75只小鼠分為正常對照組、光損傷模型對照組和低、中、高劑量給藥組，每組5只，除正常對照組外，均進(jìn)行光照處理。采用自制光損傷箱造模，箱的體積為1m3，箱內(nèi)6個面均裝有36W的冷光源熒光燈共20個，箱頂裝有排風(fēng)扇，光照箱四周及底部設(shè)有密集的通風(fēng)小孔，用數(shù)字式光照度計檢測箱內(nèi)的光照度為16 000～18 000lx。動物分組光照，每組5只。光照前先暗適應(yīng)12h，于光照前30min，用復(fù)方托吡卡胺眼藥水對所有的動物進(jìn)行雙眼散瞳，然后光照12h，再進(jìn)行暗適應(yīng)，連續(xù)3個循環(huán)，總光照時間為36h。在光照全過程中箱內(nèi)溫度保持在28～32℃。光照前給藥2W、光照后給藥1W。低、中、高給藥劑量按照成人每日每kg體重攝入量(成人桑椹和葉黃素每天推薦在攝入量分別為3g、10mg)的5、10、20倍給藥，即小鼠桑椹給藥劑量分別為0.25、0.5、1g/kg；葉黃素給藥劑量分別為0.88、1.767、3.534mg/kg，桑椹10倍水95℃溫度下提取2次，每次40min，合并濃縮至合適濃度獲得桑椹多取物，加葉黃素微囊粉制成混懸液灌胃，低、中、高給藥組小鼠灌胃量分別為0.1、0.2、0.4mL/20g。

1.4.2視網(wǎng)膜組織中SOD、MDA、CAT、GSH-PX和T-AOC檢測各組小鼠取眼球，在冰盤上小心將眼球沿角鞏膜緣剪開，去除眼前節(jié)、晶體及玻璃體，剝除視網(wǎng)膜組織，用濾紙吸掉表面多余液體，置于EP管中，保存于-80℃超低溫冰箱中，待檢測生化指標(biāo)(SOD、MDA、CAT、GSH-PX和T-AOC)使用。制備視網(wǎng)膜組織勻漿時，取出保存在-80℃液氮冰箱中的視網(wǎng)膜組織標(biāo)本，分析天平準(zhǔn)確稱量待測標(biāo)本的重量，按重量體積比1∶9 加冰生理鹽水，在冰水浴下用研磨棒將EP管中視網(wǎng)膜組織研磨成組織勻漿。4℃、2 500r/min低溫高速離心機(jī)離心15min，取上清液備用。BCA蛋白濃度、SOD、MDA、CAT、GSH-PX和T-AOC根據(jù)試劑盒說明檢測。

1.5統(tǒng)計方法

2　結(jié)果與分析

2.1桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜組織中MDA含量的影響

視網(wǎng)膜在過量光照環(huán)境中視網(wǎng)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，會產(chǎn)生大量包括MDA的活性醛類物質(zhì)，這些脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物能夠影響DNA功能，影響DNA的合成、裂解及轉(zhuǎn)錄，可損傷生物膜結(jié)構(gòu)，使視網(wǎng)膜的脂類受到不可逆損傷[12，13]。圖1表明，光照能導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜組織中MDA含量顯著增加，而攝入低、中、高受試物后，與模型組相比，MDA含量分別下降20.0%、35.6%和47.2%，其中，中、高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。

圖1　受試物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織MDA含量的影響注：#表示與正常組相比具有顯著性差異(P<0.05)；*表示與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05)，下同

2.2桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜組織中SOD活力的影響

外源性SOD作為一種抗氧化酶對視網(wǎng)膜的保護(hù)作用在以往大量實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)[14]。圖2結(jié)果表明，光照導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活力顯著下降(P<0.05)，光照射后視網(wǎng)膜組織中SOD活力降低而MDA含量升高，小鼠視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生了自由基代謝紊亂現(xiàn)象[13]，而攝入低、中、高劑量受試物小鼠，與模型對照組相比，SOD活力分別增加24.0%、50.4%和77.3%，其中，中、高劑量組具有顯著性差異(P<0.05)。

圖2　受試物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織SOD活力的影響

2.3桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜組織中CAT的影響

CAT也是體內(nèi)重要的抗氧化酶系之一，SOD或者CAT活力下降，氧自由基可損傷關(guān)鍵性亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[15]。圖3結(jié)果表明，光損傷小鼠模型視網(wǎng)膜組織中CAT活力與正常組對比下降57%(P<0.05)；攝入低、中、高劑量受試物后，與模型對照組相比CAT活力分別增加26%、69.1%和93.5%，其中中、高劑量受試物有顯著性差異(P<0.05)。

圖3　受試物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織CAT活力的影響

2.4桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜組織中GSH-Px的影響

抗氧化物酶活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[16]。圖4結(jié)果表明，光損傷模型小鼠視網(wǎng)膜組織中GSH-Px活力顯著下降(P<0.05)，低、中、高劑量模型小鼠中GSH-Px活力與模型對照組比較，分別增加13.9%、38.0%和56.5%，具有劑量效應(yīng)關(guān)系，其中，中、高劑量受試物有顯著性差異(P<0.05)。

圖4　受試物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織GSH-Px活力的影響

圖5　受試物對光損傷小鼠視網(wǎng)膜組織T-AOC活力的影響

2.5桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)對視網(wǎng)膜組織中T-AOC的影響

在機(jī)體防御體系中，T-AOC能全面地反映動物機(jī)體的抗氧化狀態(tài)，其作用是維持內(nèi)環(huán)境活性氧的動態(tài)平衡，清除過高的活性氧，使機(jī)體處于氧化還原相對穩(wěn)定的狀態(tài)[17]。圖5結(jié)果表明，光照損傷小鼠模型視網(wǎng)膜組織中T-AOC活力與正常對照組相比顯著下降(P<0.05)，低、中、高劑量模型小鼠中GSH-Px活力與模型對照組比較，分別增加15.4%、38.5%和46.2%，具有劑量效應(yīng)關(guān)系，其中，中、高劑量受試物有顯著性差異(P<0.05)。

3　結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，強(qiáng)烈的光照射可導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜抗氧化能力顯著下降，表現(xiàn)在視網(wǎng)膜組織抗氧化酶系活性降低、產(chǎn)生過量的丙二醛脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，進(jìn)而影響視網(wǎng)膜功能。采用不同劑量的桑椹提取物和葉黃素對光損傷小鼠模型聯(lián)合干預(yù)后，視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-Px和CAT等3個抗氧化體系保護(hù)酶活性顯著增加，從而顯著阻止了脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生產(chǎn)，MDA含量顯著下降，最終表現(xiàn)為能代表機(jī)體總體抗氧化狀態(tài)的T-AOC活性顯著增強(qiáng)，以上作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系，因此桑椹提取物和葉黃素聯(lián)合干預(yù)能有效抑制光損傷導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激過程。以上結(jié)果為緩解視疲勞保健食品研發(fā)提供了一定的科學(xué)依據(jù)?！?/p>

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(責(zé)任編輯李婷婷)

Effects of Fructus mori Extracts and Lutein on Antioxidant Capability in Mice After Retinal Light Exposure

CHEN Chun-yan，QIAN Cai-hong

(Hubei Vocational College of Bio-technology，Wuhan 430070，China)

Fructus moriextracts；lutein；retinallightdamage；antioxidantcapability

FoodandNutritioninChina

陳春艷(1980—)，女，碩士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。