張克山，胡彥競科，韓笑哲，高廣亮，鐘　航，王啟貴*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市肉鵝遺傳改良工程技術(shù)研究中心，重慶 402460；3.西南大學(xué)，重慶 402460)

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鵝不同繁殖時期GnRH和GnIH基因表達(dá)和激素濃度變化分析

張克山1，2，胡彥競科3，韓笑哲3，高廣亮1，2，鐘航1，2，王啟貴1，2*

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市肉鵝遺傳改良工程技術(shù)研究中心，重慶 402460；3.西南大學(xué)，重慶 402460)

旨在研究GnRH和GnIH基因和激素在鵝繁殖過程中的重要作用，本研究以產(chǎn)蛋性能差異顯著的四川白鵝和溆浦鵝為試驗材料，利用Real-time RCR方法檢測產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋期和休產(chǎn)期兩種鵝的下丘腦、垂體和卵巢組織中GnRH和GnIHmRNA的表達(dá)量；利用放射性免疫和酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清中的GnRH和GnIH激素變化情況。結(jié)果表明：GnRH和GnIH基因在四川白鵝和溆浦鵝的下丘腦、垂體和卵巢組織中均有表達(dá)；產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期的下丘腦和卵巢組織中，四川白鵝的GnRHmRNA表達(dá)量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于溆浦鵝，在產(chǎn)蛋高峰期和休產(chǎn)期四川白鵝GnRH激素濃度也極顯著(P<0.01)或顯著高于(P<0.05)溆浦鵝，在高峰期和休產(chǎn)期四川白鵝GnRH血清濃度分別為51.13和51.10 pg·mL-1，溆浦鵝分別為49.52和49.94 pg·mL-1；GnIH在兩種鵝的變化比較一致，僅在產(chǎn)蛋高峰期，四川白鵝下丘腦組織中GnIHmRNA表達(dá)水平極顯著低于(P<0.01)溆浦鵝，而兩種鵝之間的GnIH激素在各個時期均無顯著差異。這提示隨著繁殖階段的改變，在調(diào)控兩種鵝產(chǎn)蛋性能的作用過程中GnRH可能較GnIH發(fā)揮著更為重要的作用，為進一步研究鵝繁殖分子機制奠定基礎(chǔ)。

四川白鵝；溆浦鵝；GnRH基因；GnIH基因；生殖激素

中國是世界上養(yǎng)鵝最多的國家，但鵝的低繁殖力嚴(yán)重制約著養(yǎng)鵝業(yè)發(fā)展[1-2]。影響禽類繁殖性能的因素有很多，其中下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG)對繁殖機能的調(diào)控起到重要的作用[3]。促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)和促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH) 已被證明是HPG的關(guān)鍵信號分子，下丘腦接受經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)分析和整合后的各種信息，在生殖調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。GnRH選擇性調(diào)節(jié)促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)的釋放，F(xiàn)SH和LH能促進卵泡發(fā)育成熟和排卵[4]。GnIH在動物生殖軸中起著相反的調(diào)控作用，它能抑制LH和FSH的釋放，并作用于PRL的釋放[5-7]，可抑制繁殖行為，并在維持性腺的穩(wěn)定和刺激采食具有重要作用。GnIH可能在動物的季節(jié)性繁殖方面扮演著重要角色。禽類的GnRH和GnIH血清濃度和基因表達(dá)量會隨著繁殖周期的變化而發(fā)生周期變化[8-10]。研究表明，GnRH和GnIH基因突變與禽類的產(chǎn)蛋性能有顯著或極顯著的關(guān)聯(lián)[11-14]。楊海明等[15]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋高峰期鵝下丘腦和垂體GnRH基因相對表達(dá)量顯著高于休產(chǎn)期鵝；X.Luan等[16]比較了產(chǎn)蛋期與休產(chǎn)期豁眼鵝卵巢組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)兩個時期存在688個表達(dá)差異顯著的基因，其中8個基因分布在GnRH信號通路上，這提示GnRH在調(diào)控生殖階段的轉(zhuǎn)變過程中起著重要作用。 G.L.Gao等[17]比較產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋期四川白鵝垂體組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進一步證實垂體組織中的GnRH和GnIH基因在不同繁殖階段差異表達(dá)，提示GnRH和GnIH基因和激素在鵝繁殖過程中發(fā)揮重要的作用。

本研究檢測產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋期和休產(chǎn)期的四川白鵝和溆浦鵝在下丘腦、垂體和卵巢組織中GnRH和GnIH基因mRNA表達(dá)量以及血清中GnRH和GnIH激素含量，并比較兩種鵝GnRH和GnIH基因表達(dá)量和激素水平的差異，為進一步揭示動物繁殖的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1 試驗動物與組織采集四川白鵝與溆浦鵝均選自重慶市畜牧科學(xué)院安富水禽養(yǎng)殖基地，均為自然光照下予以全價日糧自由采食的健康鵝；采集產(chǎn)蛋前期(22周)、產(chǎn)蛋高峰期(44周)和休產(chǎn)期(64周)四川白鵝(5只)與溆浦鵝(5只)母鵝的下丘腦、垂體和卵巢組織，-80 ℃保存；在產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋期和休產(chǎn)期，隨機抽取四川白鵝和溆浦鵝種群中血樣各20份血液樣本，并分離出血清存儲于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑RNA抽提試劑盒購自QIAGEN生物科技有限公司(73404)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega生物科技公司(A5001)；熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司(RR820)；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；GnRH放射性免疫測定試劑盒(LBTR-10035)和GnIH ELISA檢測試劑盒(LBTR-10023)均購自北京萊博特瑞科技有限公司。

1.2方法

1.2.1Real-time PCR使用引物的設(shè)計與合成以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參，根據(jù)GenBank提供的GnRH和GnIH基因的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計引物見表1。

1.2.2組織RNA的抽提與cDNA的合成將組織加入液氮研磨成粉狀后，取適量粉末參照Qiagen試劑盒說明書提取組織總RNA；抽提的RNA取500 ng，參照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得各樣品的cDNA，將cDNA稀釋10倍后，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

表1Real-time PCR 引物序列

Table 1Primer sequences of real-time PCR

基因GeneGenBank登錄號AccessionNo.引物序列(5'-3')Primersequence產(chǎn)物大小/bpProductlengthGnRHEF495207CTGGGACCCTTGCTGTTTTGAGGGGACTTCCAACCATCAC232GnIHKC514473TATGTGCCTAGATGAACTGATGTAATGCTTCTTTCTTCTGGGTAG148GAPDHKO1458GTGGTGCTAAGCGTGTCAGGCTGGGATAATGTTCTGG303

1.2.3熒光定量PCRReal-time RT-PCR按照SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real time)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)，5 μL；正反向引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL；ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.2 μL；dH2O 2.4 μL；cDNA模板2 μL，共10 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，40個循環(huán)。以GAPDH基因作為內(nèi)參，每個組織設(shè)置3個重復(fù)。將該體系置于熒光定量PCR儀(型號：ABI7500)檢測。

1.2.4血清GnRH和GnIH激素濃度測定將收集的血清送北京萊博特瑞科技有限公司檢測血清GnRH和GnIH濃度。

2　結(jié)　果

2.1四川白鵝和溆浦鵝GnRH和GnIH基因時空表達(dá)檢測結(jié)果

GnRH和GnIH基因在四川白鵝和溆浦鵝的下丘腦、垂體和卵巢組織中均有表達(dá)(圖1)；在下丘腦、垂體和卵巢組織中，GnRH基因表達(dá)總體呈先上升后下降的趨勢，且四川白鵝中的表達(dá)量均高于溆浦鵝，但休產(chǎn)期在四川白鵝卵巢組織中，該基因表達(dá)量極顯著低于溆浦鵝(圖1 A～C)。產(chǎn)蛋前期和產(chǎn)蛋高峰期，四川白鵝的下丘腦和卵巢組織中GnRH基因mRNA表達(dá)量均顯著或極顯著高于溆浦鵝(P<0.05 或P<0.01)(圖1 A，C)；在休產(chǎn)期，垂體中的四川白鵝GnRH基因表達(dá)量顯著高于溆浦鵝(P<0.05)(圖1 B)，四川白鵝卵巢組織中GnRH基因表達(dá)量極顯著低于溆浦鵝(P<0.01)(圖1C)。

GnIH基因表達(dá)量在下丘腦和垂體組織中，總體呈上升趨勢，且四川白鵝基因表達(dá)量均高于溆浦鵝，除產(chǎn)蛋前期四川白鵝卵巢組織中該基因表達(dá)量低于溆浦鵝(圖1E，F(xiàn))；四川白鵝卵巢組織中該基因在兩種鵝中沒有一致規(guī)律，在四川白鵝中，該基因表達(dá)量先下降后上升，在溆浦鵝中該基因表達(dá)量先上升后下降(圖1D)。除產(chǎn)蛋高峰期的下丘腦組織中四川白鵝GnIH基因表達(dá)量極顯著低于溆浦鵝之外(P<0.01)(圖1 D)，在產(chǎn)蛋前期、高峰期和休產(chǎn)期，四川白鵝和溆浦鵝GnIH基因無顯著差異(圖1D～F)。

2.2四川白鵝和溆浦鵝GnRH和GnIH激素檢測

四川白鵝與溆浦鵝血清GnRH濃度在產(chǎn)蛋前期存在較大差異，分別為47.915和53.976 pg·mL-1，溆浦鵝較四川白鵝高出約12.65%，但在產(chǎn)蛋高峰期和休產(chǎn)期比較兩種鵝血清GnRH濃度時，四川白鵝分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)高于溆浦鵝，四川白鵝產(chǎn)蛋高峰期和休產(chǎn)期GnRH血清濃度分別為51.13、51.10 pg·mL-1，溆浦鵝分別為49.52、49.94 pg·mL-1(圖2 A)。四川白鵝與溆浦鵝的血清GnIH濃度都有相似的變化趨勢，先上升后下降，在產(chǎn)蛋高峰時達(dá)到峰值，分別為232.315、233.230 ng·L-1，比產(chǎn)蛋前期的147.981和143.143 ng·L-1，分別上升了56.99%和62.93%；在休產(chǎn)期的濃度分別為52.525和45.637 ng·L-1，但在產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋期和產(chǎn)蛋后期，兩種鵝之間比較GnIH激素濃度無顯著差異(圖2 B)。

未標(biāo)注為差異不顯著；*代表差異顯著(P<0.05)； **代表差異極顯著(P<0.01)，下同No mark represents no significant difference; * represents significant difference(P<0.05); ** represents great significant difference (P<0.01).The same as below圖1　四川白鵝和溆浦鵝在繁殖各階段GnRH和GnIH的mRNA相對表達(dá)情況(n=5)Fig.1　The relative expression levels of GnRH and GnIH in Sichuan White geese and Xupu geese in different phases of breeding(n=5)

圖2　不同時期四川白鵝和溆浦鵝血清GnRH和GnIH激素含量變化(n=20)Fig.2　The serum concentrations of GnRH and GnIH in Sichuan White goose and Xupu goose in different reproductive periods(n=20)

3　討　論

四川白鵝與溆浦鵝均為地方優(yōu)良水禽品種，兩種鵝均為體型中等、短日照繁殖類型，但前者年產(chǎn)蛋量60～80枚，后者年產(chǎn)蛋30枚左右[18]。下丘腦激素GnRH是啟動卵巢組織快速發(fā)育、卵泡生長成熟和排卵的首要促進因子，G.H.Son等[19]發(fā)現(xiàn)在GnRH功能缺失的小鼠會表現(xiàn)性激素大幅度降低和性腺發(fā)育障礙]，T.D.Schirman-Hildesheim等[20]發(fā)現(xiàn)在小鼠排卵前的LH峰之前會出現(xiàn)一GnRH峰；劉自逵等研究表明，22～28周齡鵝的卵巢和輸卵管形態(tài)結(jié)構(gòu)生育系統(tǒng)進入快速發(fā)育時期[21]，本試驗檢測到鵝在產(chǎn)蛋前期和高峰期的下丘腦和卵巢組織中GnRHmRNA出現(xiàn)持續(xù)性的高表達(dá)，前期高水平表達(dá)可能與GnRH促進卵巢的發(fā)育和卵泡成熟有關(guān)，而后期高水平表達(dá)可能與維持鵝的排卵有關(guān)；在進行兩種鵝GnRH激素含量比較時，筆者發(fā)現(xiàn)：在產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋高峰期和休產(chǎn)期，四川白鵝中GnRH激素濃度與溆浦鵝中的激素濃度呈顯著或極顯著差異(P<0.01或P<0.05)，尤其是在產(chǎn)蛋期階段，四川白鵝的激素水平顯著高于溆浦鵝(P<0.05)，這預(yù)示著兩種鵝GnRH激素濃度的差異可能與其產(chǎn)蛋量有關(guān)；鵝是一種光周期繁殖動物，有報道顯示，短光照可以使光周期動物褪黑素含量增加，同時促進與其有著互作關(guān)系的GnIH基因的表達(dá)量增加，進而影響動物的繁殖性能[22-23]。在本試驗中，GnIH在產(chǎn)蛋高峰期，無論是在mRNA水平還是在激素水平，GnIH的含量都處于高水平表達(dá)，這可能一方面與短日照刺激有關(guān)，而另一方面與產(chǎn)蛋期的鵝需抑制性行為與好斗行為有關(guān)；R.M.Calisi等[24]用免疫熒光的方法證實歐洲椋鳥繁殖期較非繁殖期有更高水平的GnIH肽，GnIHmRNA細(xì)胞豐度和GnIH細(xì)胞密度；T.Tachibana等[25]發(fā)現(xiàn)GnIH可通過刺激大腦中的細(xì)胞色素P450芳香化酶的活性抑制鳥類繁殖期的性行為；在比較兩種鵝GnIH的表達(dá)差異時只有在產(chǎn)蛋高峰期的下丘腦組織中表現(xiàn)出極顯著差異(P<0.01)，而在繁殖階段的各個時期GnIH激素濃度并未出現(xiàn)顯著性差異。隨著繁殖階段的改變，兩種鵝GnRH改變的幅度相較于GnIH變化更大，這提示在調(diào)控鵝產(chǎn)蛋性能的過程中GnRH發(fā)揮的作用可能較GnIH更為重要。

家禽產(chǎn)蛋性能是由排出的卵泡數(shù)量以及在輸卵管中的卵轉(zhuǎn)化成硬殼蛋的數(shù)量所決定的。在產(chǎn)蛋過程中，從卵泡形成到排卵，是由激素和其他生理條件所決定的，包括能量代謝、卵細(xì)胞和卵母細(xì)胞卵泡相關(guān)細(xì)胞的凋亡[26]。維持和活化正常卵泡功能是依靠促性腺激素，例如下丘腦和垂體分泌的GnRH、GnRH、LH 和PRL[27]。下丘腦和垂體中功能的細(xì)微差別影響繁殖性能，例如卵泡發(fā)育、排卵、產(chǎn)卵和孵化等行為[28]。本研究發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)蛋前期、產(chǎn)蛋高峰期及休產(chǎn)期中GnRH和GnIH基因及其激素的階段性變化，并在兩種鵝之間的基因表達(dá)量和激素濃度的差異，調(diào)控著鵝產(chǎn)蛋和休產(chǎn)等行為，并與四川白鵝和溆浦鵝產(chǎn)蛋性能差異相關(guān)。

綜上表明，在生殖調(diào)控過程中，GnRH和GnIH的基因和激素在鵝繁殖階段的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要作用。GnRH在產(chǎn)蛋前期促進鵝的性成熟，在繁殖期維持其排卵；而GnIH在繁殖階段的后期維持高水平表達(dá)，促進鵝由繁殖期向休產(chǎn)期轉(zhuǎn)變。

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(編輯程金華)

Analysis of the Serum Concentrations and mRNA Expression Levels ofGnRHandGnIHin Geese during Different Reproductive Periods

ZHANG Ke-shan1，2，HU Yan-jingke3，HAN Xiao-zhe3，GAO Guang-liang1，2，`ZHONG Hang1，2，WANG Qi-gui1，2*

(1.ChongqingAcademyofAnimalScience,Chongqing402460，China;2.ChongqingEngineeringResearchCenterofGooseGeneticImprovement,Chongqing402460，China；3.SouthwestUniversity,Chongqing402460，China)

To investigate the role of gonadotropin-releasing hormone and gonadotropin-inhibitory hormone genes (GnRHandGnIH，respectively)during the reproductive process of geese，the Sichuan White goose and Xupu goose were selected as experimental animals.We detected the mRNA expression profiles ofGnRHandGnIHin the hypothalamus，pituitary and ovary tissues using real-time reverse transcription PCR.Serum concentrations of GnRH and GnIH were respectively measured using radio immunoassay and ELISA during prelaying and laying periods and the period when laying ceased.GnIHandGnRHmRNA were expressed in the hypothalamus，pituitary and ovary tissues.GnRHmRNA expression of the hypothalamus and the ovary were significantly higher in Sichuan White geese than in Xupu geese in both prelaying and laying periods，particularly in the latter.Serum GnRH concentrations were significantly higher or higher in Sichuan White geese (51.13 and 51.10 pg·mL-1) than in Xupu geese(49.52 and 49.94 pg·mL-1) during the laying and cease period，respectively.During the laying period，GnIHmRNA expression of Sichuan White geese was significantly lower than in Xupu geese；however，there were no significant differences inserum GnIH concentrations between the 2 geese during prelaying，laying or cease periods.These results indicate thatGnRHis more important thanGnIHin regulating laying performance and changing the laying stages which establishes the foundation for understanding the breeding mechanisms of geese.

Sichuan White geese；Xupu geese；GnRH；GnIH；reproductive hormone

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.025

2016-02-25

重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿研究(cstc2014jcyjA80021)；重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(14305);國家自然科學(xué)基金(31572386)

張克山(1988 )，女，四川達(dá)州人，助理研究員，碩士，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail：zhangksh1988@163.com

王啟貴，教授，博士，主要從事家禽遺傳育種研究，E-mail: wangqigui@hotmail.com

S835.2

A

0366-6964(2016)08-1720-07