胡庭溪，劉　霞，孫尉峻，郝海生，趙學(xué)明，王宗禮，杜衛(wèi)華*，朱化彬

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070)

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精子動力學(xué)分析與其體內(nèi)、體外受精能力的相關(guān)性

胡庭溪1，2，劉霞1，孫尉峻1，郝海生1，趙學(xué)明1，王宗禮2，杜衛(wèi)華1*，朱化彬1

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070)

旨在通過對精子動力學(xué)參數(shù)的分析，預(yù)測其在體外受精和人工授精中的受精能力。本研究采用計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASA)對3頭荷斯坦公牛的性控分離精子進(jìn)行動力學(xué)檢測；同時進(jìn)行體外受精和人工授精試驗，統(tǒng)計體外受精的受精率、卵裂率、囊胚率、囊胚細(xì)胞數(shù)(TCN)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)/囊胚細(xì)胞數(shù)比例(ICM/TCN)和人工授精妊娠率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精子的路徑速度(102.82、91.55、80.67)、曲線速度(201.75、180.23、168.58)、側(cè)擺幅度(9.33、8.31、7.42)在公牛A、B、C間呈顯著差異(P<0.05)，并與其體外受精過程中的受精率、胚胎卵裂率呈顯著正相關(guān)。公牛A精子的鞭打頻率(20.36)、直線性(46.06)顯著高于公牛B(18.05、42.00)、C(16.23、40.81)，且與體外受精的囊胚率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。公牛A、B精子的活力(38.00、36.50)、直線速度(80.62、79.00)顯著高于公牛C(29.00、68.20)，該參數(shù)與ICM/TCN呈正相關(guān)(P<0.05)。然而精子動力學(xué)的所有參數(shù)均與人工授精的妊娠率之間無相關(guān)性。綜上表明，精子的動力學(xué)參數(shù)可以預(yù)測體外受精中公牛的受精能力，但對其人工授精結(jié)果的預(yù)測還需要進(jìn)一步研究。

性控精子；動力學(xué)分析；體外受精；人工授精

應(yīng)用性控凍精進(jìn)行人工授精，是快速擴(kuò)繁奶牛和肉牛的有效途徑之一。然而在實際生產(chǎn)中，性控精液存在精子數(shù)較少，精子質(zhì)量以及其受精能力普遍偏低等缺點。據(jù)報道在分離和冷凍過程中受到染色孵育、高倍稀釋、分離中的機械力、紫外線照射、高壓、離心以及冷凍解凍等多種外在因素的作用下產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)[1]，從而對精子線粒體膜電位，DNA完整性以及質(zhì)膜結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷[2]，導(dǎo)致精子的運動性能和受精能力降低，形態(tài)和頂體狀態(tài)發(fā)生改變[3]。因此，在人工授精前預(yù)測性控精子的受精能力有著至關(guān)重要的意義。

傳統(tǒng)方法通過測定活力、密度、pH、受精率、未返情率以及受胎率來進(jìn)行種公牛受精能力的預(yù)測[4]，但是上述某些方法中存在檢測周期較長，過程繁瑣，檢測人員的主觀判斷對結(jié)果的影響較大。對于未返情率、受精率以及受胎率來說，母畜所處環(huán)境、飼養(yǎng)條件和激素分泌水平等都會對結(jié)果造成嚴(yán)重影響。

計算機輔助分析(Computer-assisted sperm analysis，CASA)是結(jié)合計算機技術(shù)與圖像處理技術(shù)應(yīng)用于精子動力學(xué)參數(shù)分析，通過對精子頭部運動圖像的捕捉，采集精子運動軌跡并進(jìn)行快速、動態(tài)處理分析，從而檢測精子質(zhì)量。CASA分析儀測定的精子動力學(xué)參數(shù)的量化數(shù)據(jù)包括直線速度側(cè)擺幅度(ALH)、直線速度(VSL)、鞭打頻率(BCF)、曲線速度(VCL)、前向性(STR)、路徑速度(VAP)、直線性(LIN)、擺動性(WOB)等。研究表明，CASA一致性與可重復(fù)性均優(yōu)于傳統(tǒng)精子檢測方法，能快速準(zhǔn)確地測定精子的活率、活力、密度等參數(shù)同時還可以提供描述精子運動狀態(tài)的多種參數(shù)[5]。本研究將3頭種公牛性控精子的CASA分析、體外受精以及人工授精的結(jié)果相結(jié)合，以期尋找一種簡單、高效的方法進(jìn)行種公牛受精能力評估，為今后奶牛人工授精過程中種公牛的選擇提供試驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

選擇年齡基本相同、體重相近、健康狀況良好的3頭荷斯坦種公牛，編號：607H08398(A)、614H005042(B)、614H004670(C)。參配母牛則選擇14～17月齡育成牛，體況較好，膘情中等，正常發(fā)情，生殖系統(tǒng)正常，無繁殖疾病的荷斯坦奶牛。3頭種公牛的精液均是采精當(dāng)天進(jìn)行性別分離，并分裝后冷凍保存于液氮中。然后，于一周內(nèi)運至實驗室，解凍后進(jìn)行動力學(xué)參數(shù)測定；2個月內(nèi)完成體外受精和人工授精試驗。

1.2試劑和儀器

除特殊說明外，本研究所有試劑均購于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司(上海)。流式細(xì)胞儀(EPICS?ALTRATM，美國)；計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASA，Hamilton Thorne，美國)；精子計數(shù)板(LEJA，荷蘭)；熒光倒置顯微鏡(尼康，日本)；CO2培養(yǎng)箱(Forma，美國)。

1.3精液的分離和冷凍

對于3頭公牛，分別吸取一定量精液原液待分離，用Hepes緩沖液稀釋將原液稀釋至2×108個·mL-1，向精子稀釋液中加入0.1 mmol·L-1H33342，將稀釋液置于34 ℃水浴中染色45 min，用含有5%食品紅和4%卵黃的Hepes緩沖液將濃度稀釋至1×108個·mL-1，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行精子分離與回收，將分離出的X-精子用Hepes緩沖液將精子密度調(diào)整為1×107個·mL-1。裝入0.25 mL凍精管中，采用常規(guī)精液的冷凍方法冷凍后,置于液氮中保存。

1.4精子動力學(xué)參數(shù)分析

應(yīng)用CASA系統(tǒng)對3頭公牛個體的性控分離精子進(jìn)行動力學(xué)參數(shù)檢測。將性控凍精細(xì)管從液氮中取出后投入38 ℃水浴鍋中解凍。吹打混勻后取100 μL進(jìn)行檢測。參數(shù)包括活力、VAP(μm·s-1)、ALH(μm·s-1)、VSL(μm·s-1)、VCL(μm·s-1)、STR(%)、LIN(%)、BCF(次數(shù)·s-1)。每支精液重復(fù)檢測3次以上。

1.5牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)

將屠宰場采集的牛卵巢置于37 ℃生理鹽水中保存，2～3 h內(nèi)送達(dá)實驗室。使用真空泵收集牛卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(Cumulus-oocyte complexes，COCs)。卵巢用37 ℃添加適量鏈霉素和青霉素的無菌生理鹽水洗滌3次。用真空蠕動泵抽取卵巢表面直徑為2～8 mm卵泡中的卵泡液。將3層以上卵丘細(xì)胞的COCs洗滌2次后，用38.5 ℃預(yù)熱的成熟液洗滌2次，放入平衡2 h成熟液中(750 μL成熟液培養(yǎng)50枚COCs)。在5% CO2、38.5 ℃和飽和濕度的條件下成熟培養(yǎng)22～24 h。

1.6性控精液的體外受精和胚胎的體外培養(yǎng)

取3頭公牛性控精液，在38 ℃水浴解凍后，將精液于適量洗精液中洗滌2次，800 g離心5 min，棄上清液；加入受精液將精子密度調(diào)整為1×106個·mL-1，將95 μL已混勻精子加入至5 μL受精液中，形成100 μL受精滴。將體外成熟22～24 h的COCs用0.25%透明質(zhì)酸酶消化1 min，加入終止液終止消化反應(yīng)。終止液洗滌2次后移入受精液洗滌1次，吸取含有2～3層顆粒細(xì)胞的COCs，放入受精滴中(100 μL受精液培養(yǎng)30枚COCs)。精卵共孵育8 h。COCs在適量mCRlaa液中充分洗滌，去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞及精子，于100 μL mCRlaa微滴中培養(yǎng)。48 h后，更換為mCRlaa + 10%FBS培養(yǎng)液，之后每隔1天半量換液。體外培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計各組卵裂胚胎個數(shù)，計算卵裂率；培養(yǎng)7～8 d后，統(tǒng)計各組囊胚數(shù)，計算囊胚率。

1.7受精率的檢測

將體外成熟8 h的卵母細(xì)胞用0.25%透明質(zhì)酸酶消化2 min，去除卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞及精子。在5% BSA-PBS中洗2遍，于0.1 mmol·L-1H33342中室溫孵育15 min，移至5% BSA-PBS中洗2遍，置于熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照。卵母細(xì)胞中有1個原核的為未受精，有2個原核的為正常受精，2個以上原核的為多精受精。最后統(tǒng)計受精率(兩個原核的卵母細(xì)胞數(shù)/檢測的卵母細(xì)胞總數(shù))，每頭公牛取60枚卵母細(xì)胞進(jìn)行檢測，分為3組，每組20枚。

1.8囊胚差異染色

培養(yǎng)7 d后獲得的囊胚用37 ℃、0.5% BSA-

PBS洗滌3次。置于2%多聚甲醛中固定20 min，于20 μL通透液(0.5% Triton X-100和0.05% Tween-20溶于PBS溶液)中室溫孵育30 min。經(jīng)通透處理的囊胚于0.5%BSA-PBS中洗滌3次，取出囊胚，在1 mol·L-1HCL中室溫處理30 min，然后迅速轉(zhuǎn)移至100 mmol·L-1TrisHCL中，室溫處理20 min。置于0.5% BSA-PBS中洗滌3次，將囊胚移至封閉液(10%山羊血清和0.05%Tween-20溶于PBS溶液)中，4 ℃封閉過夜。將囊胚置于1∶500用封閉液稀釋的一抗(鼠抗人CDX2抗體)中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h；于0.5% BSA-PBS中洗滌3次，放入1∶500用封閉液稀釋的二抗(羊抗鼠Alexa Fluor 488抗體)中，室溫避光孵育2 h。移入0.5% BSA-PBS清洗囊胚3次，于20 μmol·L-1H33342中避光室溫孵育10 min，囊胚于0.5% BSA-PBS中洗滌后壓片，在熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照。在熒光顯微鏡下，藍(lán)色為所有的囊胚細(xì)胞，紅色為滋養(yǎng)層細(xì)胞。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)(ICM)=囊胚細(xì)胞數(shù)(TCN)-滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)(TE)。

1.9性控精液的人工授精

在10個牛場中共選擇950頭青年荷斯坦母牛。按照性控精液的輸精方法，將3頭公牛的性控精液進(jìn)行人工授精。輸精60 d后做直腸妊檢，統(tǒng)計妊娠率。

1.10數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計囊胚細(xì)胞使用Photoshop CS 5(Adobe，美國)計數(shù)功能進(jìn)行計數(shù)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SAS 9.2軟件分析數(shù)據(jù)，百分?jǐn)?shù)比較經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)化后進(jìn)行方差分析，試驗結(jié)果為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”，P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)　果

2.1性控精子的動力學(xué)參數(shù)分析

如表1所示，3頭公牛精子的活力、VSL的差異顯著性成相同的趨勢，即公牛A精子的活力、VSL與公牛B差異不顯著(P>0.05)，但二者均顯著高于公牛C(P<0.05)；對于VCL、VAP、ALH參數(shù)，公牛A精子顯著高于公牛B、C(P<0.05)，而公牛B又顯著高于公牛C(P<0.05)。公牛B、C精子間的BCF、LIN無顯著差異(P>0.05)，均顯著低于公牛A(P<0.05)。3頭公牛精子間的STR無顯著差異(P>0.05)。

表1不同公牛精子的動力學(xué)參數(shù)

Table 1Kinetics parameters of sperm from different bulls

公牛號BullNo.活力/%Vitality曲線速度VCL直線速度VSL側(cè)擺幅度ALH鞭打頻率/%BCF直線性LIN前向性STR路徑速度VAPA38.00±1.41a201.75±1.43a80.62±0.74a9.33±0.03a20.36±0.45a46.06±0.61a79.52±0.56a102.82±0.92aB36.50±2.12a180.23±5.93b79.00±1.68a8.31±0.08b18.05±0.38b42.00±1.14b79.09±0.53a91.55±1.02bC29.00±1.41b168.58±2.47c68.20±0.08b7.42±0.05c16.23±1.38b40.81±1.53b78.05±1.16a80.67±1.89c

肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。下同

Values with different superscripts within the same column differ significantly (P<0.05).The same as below

2.2性控精子受精率比較

如表2所示，對于性控分離精子體外受精的受精率，3頭公牛間均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。其中，公牛A精子的受精率最高(72.63%)，公牛C的最低(43.57%)。

表2不同公牛精子的受精率

Table 2Fertilization rate of sorted sperm from different bulls during IVF

公牛號BullNo.卵母細(xì)胞數(shù)/枚No.oftotaloocytes受精率/%(枚)FertilizationrateA6072.63±7.72a(43)B6057.60±3.57b(34)C5443.57±3.66c(24)

2.3性控分離精子體外受精胚胎的體外發(fā)育

如表3所示，對于體外受精胚胎的卵裂率，3頭公牛間均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。其中公牛A最高(58.90%)，公牛C的最低(40.00%)。對于囊胚率，公牛A精子的囊胚率(32.00%)顯著高于公牛B、C(27.63%、25.77%)(P<0.05)，而后兩者間則無顯著差異(P>0.05)。

表3不同公牛的性控精子對IVF胚胎體外發(fā)育的影響

Table 3Effect of sorted sperm from different bulls on development of bovine IVF

公牛號BullNo.卵裂率/%(枚)Cleavagerate囊胚率/%(枚)BlastocystrateA58.90±1.91a(70)32.00±2.25a(23)B52.20±1.91b(62)27.63±3.20b(17)C40.00±3.30c(48)25.77±1.33b(12)

卵母細(xì)胞數(shù)為120

No.of total oocytes is 120

2.4性控精子體外受精囊胚差異染色結(jié)果

如表4所示，公牛A精子獲得的囊胚細(xì)胞數(shù)(115.33)顯著高于公牛B、C(109.00、106.00)(P<0.05)，后兩者間差異不顯著(P>0.05)。公牛A、B精子獲得的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)(30.00、26.00)差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于公牛C(19.00)，(P<0.05)。而ICM/TCN在3頭公牛間的差異顯著性與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)相同。

表4不同公牛的性控囊胚中ICM細(xì)胞數(shù)、囊胚細(xì)胞數(shù)及其比例

Table 4The ICM，TCN and ICM/TCN ratio of bovine blastocyst obtained from sorted sperm

公牛號BullNo.囊胚數(shù)量No.ofblastocysts囊胚細(xì)胞數(shù)TCN內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)ICMICM細(xì)胞數(shù)/囊胚細(xì)胞總數(shù)/%ICM/TCNA15115.33±3.05a30.00±2.00a26.60±2.29aB13109.00±4.00b26.00±3.61a23.77±2.42aC17106.00±2.00b19.00±1.00b18.97±0.91b

2.5性控精液人工授精的結(jié)果

如表5所示，3頭公牛的性控精液在人工受精后，受胎率間無顯著差異。其中，公牛B精液的受胎率最高，公牛C最低。

表5不同公牛性控精液人工授精的結(jié)果

Table 5Pregnancy rate of sorted semen from different bulls in AI

公牛號BullNo.配種母牛頭數(shù)No.ofinseminatedcows情期妊娠頭數(shù)No.ofpregnantcows妊娠率/%PregnancyrateA1505939.3aB37717546.4aC42316037.8a

3　討　論

本研究對3頭公牛的精子活力、動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行檢測，并與其在體內(nèi)、體外環(huán)境下的受精能力及胚胎發(fā)育水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，精子的動力學(xué)參數(shù)與IVF胚胎發(fā)育具有相關(guān)性，而與AI受胎率沒有相關(guān)性。精子的運動特性是反映其質(zhì)量的有效指標(biāo)之一[6]，本研究中精子的動力學(xué)各參數(shù)均高于其它組的公牛A，其IVF受精率、胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)均顯著高于其它兩組，可見精子運動能力強可保證其準(zhǔn)確到達(dá)受精部位以穿透卵丘細(xì)胞和透明帶[7]。3頭公牛精子的VAP、VCL、ALH分別與其IVF受精率、胚胎的卵裂率具有顯著的相關(guān)性，即VCL和VAP對卵裂率、受精率有顯著影響[8]；A.H.Ben也認(rèn)為該參數(shù)與精子受精能力相關(guān)，可促進(jìn)精卵結(jié)合[9]。另外，本研究3頭公牛精子的LIN、BCF參數(shù)與其IVF胚胎的囊胚率呈正相關(guān)；動力學(xué)參數(shù)與AI受胎率間無相關(guān)性，A.Januskauskas等[10]和J.Ehlers等[11]也得到類似的結(jié)論；也有研究認(rèn)為VLP、ALH、LIN與AI結(jié)果有顯著的正相關(guān)性[12-15]，其原因可能與測定的精子數(shù)、精液樣本量、及AI操作人員的差異有關(guān)。

ICM/TCN是衡量囊胚質(zhì)量的一個重要標(biāo)志，與活力、VSL成正相關(guān)，即精子質(zhì)量與其受精之后所獲得的囊胚質(zhì)量有密切關(guān)系，但相關(guān)報道較少，還需要進(jìn)一步的深入研究。

目前，精子IVF受精率、胚胎卵裂率、囊胚率與AI受胎率的關(guān)系尚不明確，本研究認(rèn)為二者無顯著相關(guān)性。有關(guān)豬、牛的研究也認(rèn)為，IVF結(jié)果與精液品質(zhì)、AI結(jié)果均不一致[16-18]。也有研究認(rèn)為IVF結(jié)果對預(yù)測AI結(jié)果有重要作用[19-20]。兩種不同結(jié)果可能與各自體內(nèi)、體外試驗中的體系、環(huán)境、操作流程等因素有關(guān)，如精子在體外受精過程中極易與ROS反應(yīng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化[21]；而精液的洗滌去除精漿中所含的谷胱甘肽等抗氧化劑[22]，使質(zhì)膜及內(nèi)部細(xì)胞器更易受到ROS攻擊[23]，因此對于不同的體系、操作流程和時間，ROS的損傷程度不同。此外，母牛自身狀態(tài)對AI結(jié)果也有較大影響，所以這些因素都會導(dǎo)致AI結(jié)果無法預(yù)測。

4　結(jié)　論

隨著國內(nèi)養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展和對優(yōu)質(zhì)公牛需求的日益增加，利用現(xiàn)代化繁育技術(shù)快速擴(kuò)繁良種公牛，加快種公牛精液性控分離和冷凍保存的研究是目前牛育種和繁殖工作的重點[24]。因而通過CASA分析性控分離精子的動力學(xué)參數(shù)來預(yù)測公牛的受精能力顯得更為重要。人工授精過程中的影響因素較多，精子的動力學(xué)參數(shù)與人工授精妊娠率之間的相關(guān)性還需要進(jìn)一步地研究。

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(編輯程金華)

Correlation between Sperm Kinetics Parameters and Fertility of Holstein Sex-sorted Sperminvitroandinvivo

HU Ting-xi1，2，LIU Xia1，SUN Wei-jun1，HAO Hai-sheng1，ZHAO Xue-ming1，WANG Zong-li2，DU Wei-hua1*，ZHU Hua-bin1

(1.InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology，GansuAgriculturalUniversity，Lanzhou730070，China)

This study was performed to predict fertility of bull sperm duringinvitrofertilization (IVF) and artificial insemination (AI) according to its kinetics parameters.The sex-sorted sperm from 3 Holstein bulls were estimated with computer assisted sperm analysis system (CASA).Moreover，the IVF and AI with those sperm were carried out.The rate of fertilization，embryo cleavage，blastocyst formation and TCN，ICM/TCN of blastocyst obtained by IVF，conception rate during AI were counted and analyzed.Results showed that VAP (102.82vs91.55vs80.67)，VCL (201.75vs180.23vs168.58)，ALH (9.33vs8.31vs7.42) of sperm were significantly different among bull A，B，C (P<0.05).Additionally above 3 parameters were positively correlated with the fertilization rate，cleavage rate of IVF embryos.Sorted sperm from bull A had a significantly higher BCF (20.36vs18.05 & 16.23) and LIN (46.06vs42.00 & 40.81) than that from bull B，C (P<0.05).Also，the 2 parameters were positively correlated with blastocyst rate of IVF embryos.Vitality (29.00vs38.00 & 80.62)，VSL (68.20vs36.50 & 79.00) of sperm from bull C were significantly lower than that from bull A and B (P<0.05)，and had a positive correlation with ICM/TCN of blastocysts.However there was no correlation between the kinetics parameters and conception rate in AI.Conclusively，the fertility of sperm in IVF can be predicted by the kinetics analysis，but that prediction in AI requires further research.

sex-sorted sperm；kinetics analysis；fertilizationinvitro；artificial insemination

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.026

2016-03-14

國家科技支撐項目(2012BAD12B01-2)；家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團(tuán)隊(ASTIP-IAS06-2016)；基本科研業(yè)務(wù)費重點項目(2013ywf-zd-2)

胡庭溪(1987-)，男，遼寧沈陽人，博士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：htx19871005@126.com

杜衛(wèi)華，博士，副研究員，E-mail：dwh@iascaas.net.cn

S823.3+4

A

0366-6964(2016)08-1727-06