權(quán)素玉，張?jiān)词纾返桥?/p>

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 3.CAAS-ICRAF農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱 150030)

?

熱應(yīng)激造成奶牛乳腺上皮細(xì)胞損傷并影響乳合成相關(guān)載體的基因表達(dá)

權(quán)素玉1，2，張?jiān)词?*，卜登攀2，3，4*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 3.CAAS-ICRAF農(nóng)用林業(yè)與可持續(xù)畜牧業(yè)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193； 4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱 150030)

本試驗(yàn)以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，旨在尋找熱應(yīng)激下調(diào)奶牛泌乳功能的相關(guān)因素。42 ℃高溫處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞0、0.5、1、1.5、2、4、8 及12 h，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活率，線粒體膜電位，熱休克分子及蛋白基因、氧化應(yīng)激相關(guān)基因以及氨基酸和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，不同時(shí)間熱處理顯著降低乳腺上皮細(xì)胞活率(P<0.05)，損傷細(xì)胞線粒體膜電位。HSP27基因表達(dá)顯著下降(P<0.05)，HSP70基因表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，HSP90基因表達(dá)在前4 h顯著上調(diào)(P<0.05)，后恢復(fù)至正常水平，HSF-1基因表達(dá)在某些時(shí)間點(diǎn)顯著上調(diào)(P<0.05)。氧化應(yīng)激相關(guān)基因Keach樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1 (Keap1)表達(dá)無(wú)顯著變化 (P>0.05)，核因子E2相關(guān)因子2 (Nrf2) 表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，NAD(P)H脫氫酶醌-1 (NQO1) 表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)?？缒ぐ被徂D(zhuǎn)運(yùn)載體SLC7A7基因表達(dá)在1 h和4 h顯著上調(diào)(P<0.05)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT1及GLUT8基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT12在熱處理0～2 h表達(dá)顯著上調(diào)，4～12 h顯著下調(diào)(P<0.05)。熱應(yīng)激能夠顯著降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞活率，引起氧化應(yīng)激，改變熱休克蛋白和分子及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)。

熱應(yīng)激；牛乳腺上皮細(xì)胞；細(xì)胞活力；線粒體膜電位；氧化應(yīng)激；熱休克蛋白；跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體

熱應(yīng)激(Heat stress)可簡(jiǎn)單定義為動(dòng)物機(jī)體自身產(chǎn)生的熱量或者從外界吸收的熱量不能充分散發(fā)出去時(shí)，機(jī)體為了維持體溫平衡時(shí)的一種狀態(tài)[1]。已有研究證實(shí)，周?chē)h(huán)境溫度過(guò)高引起的熱應(yīng)激不利于奶牛的泌乳、生長(zhǎng)和繁殖，其對(duì)乳制品行業(yè)產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)損失尤為嚴(yán)重[2]。熱應(yīng)激不僅顯著降低乳產(chǎn)量，而且對(duì)乳品質(zhì)也有很大的影響，基于熱應(yīng)激的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間不同，其對(duì)乳糖含量[3-4]、乳脂含量[5]、乳蛋白含量的影響也不一致，并且熱應(yīng)激可能影響乳蛋白的合成機(jī)制，尤其是β-酪蛋白的合成[6]。

奶牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)高溫(42 ℃)產(chǎn)生快速應(yīng)激反應(yīng)，以熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSF(Heat shock transcription factor，HSF) 和熱休克蛋白HSP(Heat shock protein，HSP) 基因表達(dá)顯著改變?yōu)闃?biāo)志[7]。Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路介導(dǎo)的II相解毒酶和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄是細(xì)胞抗氧化機(jī)制中最重要的通路[8]，熱應(yīng)激可造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，上調(diào)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路及其下游基因HO-1和NQO1的表達(dá)[9]。

氨基酸和葡萄糖分別是乳蛋白及乳糖合成的主要前體物，血液中的氨基酸和葡萄糖必須通過(guò)特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入乳腺上皮細(xì)胞后才能用于乳蛋白和乳糖的合成，這些轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)包括氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體SLC1家族、SLC7家族、SLC38家族，SLC43家族及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Glucose transporter，GLUT) SLC2家族等[10]。目前，雖然鑒定出的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體數(shù)量與日俱增，但其在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及乳腺上皮細(xì)胞泌乳中的功能研究較少，胡菡等[7]研究發(fā)現(xiàn)，高溫(42 ℃)處理顯著影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂肪和乳蛋白合成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)豐度。

本試驗(yàn)采用奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，通過(guò)42 ℃高溫引起熱應(yīng)激，探討熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞活率，熱休克蛋白、跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響，為尋找熱應(yīng)激降低奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的機(jī)制提供參考。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑

3111型 CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))，D-37520離心機(jī)(Thermo，美國(guó))，4F00318倒 置 顯 微 鏡(Olympus，日本)，NanoDrop1000(Thermo，美國(guó))，TC10細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Bio-Rad，美國(guó))，EV Eleeh酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))，IQ5 熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad，美國(guó)) 等。

DMEM/F12 培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))，F(xiàn)BS(Gibco，美國(guó))，胰酶(碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó))，RNeasy Plus Universal Mini Kit (QIAGEN，德國(guó))，Prime ScriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase (TaKaRa，日本)，噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，美國(guó))、 二甲基亞砜(DMSO，Sigma，美國(guó))，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天，中國(guó))等。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞培養(yǎng)參照H.Hu等[11]的方法。具體如下：細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5% CO2，對(duì)照組38 ℃，高溫應(yīng)激組42 ℃。

用培養(yǎng)基懸浮凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，38 ℃培養(yǎng)3代使其穩(wěn)定。胰酶消化細(xì)胞后以1×104個(gè)·mL-1的密度接種到中號(hào)培養(yǎng)皿，每皿5 mL細(xì)胞懸液。于倒置顯微鏡觀察，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%后轉(zhuǎn)移至42 ℃分別培養(yǎng)0.5、1、1.5、2、4、8、12 h，以38 ℃培養(yǎng)條件為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。1.2.2細(xì)胞活率檢測(cè)MTT法檢測(cè)。將生長(zhǎng)旺盛的牛乳腺上皮細(xì)胞鋪于96孔板，細(xì)胞懸液密度為1×105個(gè)·mL-1，每孔200 μL，在接種孔的四周每孔加入200 μL培養(yǎng)基，防止“邊緣效應(yīng)”。于38 ℃培養(yǎng)，通過(guò)倒置顯微鏡觀察，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿時(shí)，置于42 ℃分別培養(yǎng)0、0.5、1、1.5、2、4、8、12 h后加入含0.5 mg·mL-1的MTT培養(yǎng)基，于38 ℃孵育4 h。棄去孔中培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃ 孵育10 min，分別于570 nm，630 nm測(cè)其吸光度。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。細(xì)胞活率按如下公式計(jì)算[12]：

細(xì)胞活率(%)=(熱處理組OD570 nm-熱處理組OD630 nm)/(對(duì)照組OD570 nm-對(duì)照組OD630 nm)×100/%。

1.2.3線粒體膜電位檢測(cè)JC-1是理想的檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位熒光探針，當(dāng)細(xì)胞線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光，當(dāng)膜電位較低時(shí)，JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光，我們用紅綠熒光的比例來(lái)衡量線粒體膜電位的變化。以38℃培養(yǎng)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，42 ℃培養(yǎng)1.5 h的細(xì)胞作為試驗(yàn)組(細(xì)胞活率檢測(cè)結(jié)果可知，1.5 h熱應(yīng)激細(xì)胞活率最低，細(xì)胞損傷最嚴(yán)重)，CCCP誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照組，檢測(cè)熱應(yīng)激1.5 h對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的損傷。

1.2.4細(xì)胞相關(guān)基因Real-time PCR 檢測(cè)細(xì)胞總RNA提?。翰捎?RNeasy Plus Universal Mini Kit(QIAGEN，Germany) 提取細(xì)胞RNA，所提取RAN用紫外分光光度計(jì)Nanodrop 測(cè)定濃度，并將其濃度調(diào)整至500 ng·μL-1，用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄：采用Prime ScriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase (TaKaRa，Japan) 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄總體系為10 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存，獲得cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物合成：HSF-1、HSP27、HSP70、HSP90、RPS9引物序列參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[13]。GLUT1、GLUT8、GLUT12引物序列參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[14]，Keap1、Nrf2、HO-1、NQO1基因分別參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]和[16]，SLC7A5、SLC7A7、SLC38A2、SLC43A1 的擴(kuò)增引物由Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)。所有引物由北京華大基因公司合成，詳見(jiàn)表1。

采用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，20 μL反應(yīng)體系中：SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)10 μL，PCR Forward primer 0.8 μL，PCR Reverse primer 0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase-free H2O，6 μL，ROX Reference DyeⅡ，0.4 μL。反應(yīng)條件：第1階段：95 ℃ 30 s，1 個(gè)循環(huán)；第2階段：95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，然后完成熔解曲線。

以核糖體蛋白R(shí)9(RPS9)[12]作為內(nèi)參基因，2-ΔΔCT[15]法對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞熱休克因子HSF-1，熱休克蛋白HSP27、HSP70、HSP90，抗氧化基因Keap1、Nrf2、NQO1，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體GLUT1、GLUT8、GLUT12，跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體SLC7A5、SLC7A7、SLC38A2、SLC43A1基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步整理后，以SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，之后進(jìn)行Duncan 氏多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，顯著水平為P<0.05。

2　結(jié)　果

2.1不同時(shí)間熱處理對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活率的影響

不同時(shí)間熱處理對(duì)細(xì)胞活率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，不同時(shí)間熱處理均顯著降低了細(xì)胞活率。在0～1.5 h細(xì)胞活率持續(xù)降低，于2 h后開(kāi)始恢復(fù)。推測(cè)熱應(yīng)激2 h后細(xì)胞逐漸適應(yīng)高溫環(huán)境，存活率短期內(nèi)不再下降。

2.2熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響

熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響見(jiàn)圖2。圖2中A為陰性對(duì)照組，B為熱應(yīng)激組，C為陽(yáng)性對(duì)照組，可看出陰性對(duì)照組主要顯示紅色熒光，表明細(xì)胞線粒體膜電位較高，熱應(yīng)激組綠色熒光多于陰性對(duì)照組，表明細(xì)胞線粒體膜電位降低，細(xì)胞損傷，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞幾乎全部損傷，顯示綠色熒光。

2.3不同時(shí)間熱處理對(duì)熱休克因子(HSF-1)及熱休克蛋白(HSPs)基因表達(dá)的影響

不同時(shí)間熱處理對(duì)熱休克因子(HSF-1)及熱

表1引物信息

Table 1The information of primer designed

基因GeneGenBank序列號(hào)GenBankaccessionNo.引物序列(5'-3')PrimersequenceHSF-1NM_001076809F:AAAGATCCCCCTGATGCTGAACGACR:CAGTTCGGTGATGTCGGAGATGATGHSP27BT021550F:CGGACGCACCAGACCAGCCAGCATR:GGCTGTGGGCCGGATACCAGTCGCGHSP70X53827F:CTGAACCCGCAGAACACGR:CCTTGGTCTCCCCTTTGTHSP90NM_001079637F:CCAAGTCTGGCACTAAAGR:GAAGACTCCCAAGCATACSCLC7A5NM_174613.2F:GCTCGTCTTCGCCACCTACCR:GCCTTCACGCTGTAACAGTTCASLC7A7NM_001075151.1F:CATGGCGTTGATCTATTTGTR:CCTGTTGGGCTCCTTCCSLC43A1NM_001206598.1F:TGAGACGGATGACCTGAAGCR:GGTGGTCTGACGGACTTGGSLC38A2NM_001082424.1F:AAGCCATTATGCCGATGTR:GGATTCCACTGCCCACARPS9DT860044F:CCTCGACCAAGAGCTGAAGR:CCTCCAGACCTCACGTTTGTTCGLUT1NM_174602F:GTGCTCCTGGTTCTGTTCTTCAR:GCCAGAAGCAATCTCATCGAAGLUT8NM_201528F:AGTGACTGCCCGTCCTTGCTR:TGCTGTCCTGGCTCCTGACTGLUT12NM_00101168F:AAGATGCTGCCCACCTACGR:TCGCTTCCCATTCCTCACAKeap1NM_001101142.1F:TCACCAGGGAAGGATCTACGR:AGCGGCTCAACAGGTACAGTNrf2NM_001011678F:CCCAGTCTTCACTGCTCCTCR:TCAGCCAGCTTGTCATTTTGHO-1NM_001014912F:AGACTTGGCTCCCACCAAR:AGGTGCCTGGGAGAGGACNQO1NM_001034535F:CGGAATAAGAAGGCAGTGCTR:CCATGGATACCATGCAGAGA

圖1　不同時(shí)間熱處理對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig.1　Effects of different heat treatment time on cell vitality

A.陰性對(duì)照；B.熱應(yīng)激組；C.陽(yáng)性對(duì)照組A.Negative control group；B.Heat stress group；C.Positive control group圖2　熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響 200×Fig.2　Effects of heat stress on cell mitochondrial membrane potential 200×

休克蛋白(HSPs)基因表達(dá)的影響見(jiàn)表2。由表2可知，隨著熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)，HSP27表達(dá)量持續(xù)并顯著降低(P<0.05)。HSP70的基因表達(dá)顯著上升，2 h其表達(dá)量達(dá)到峰值(P<0.05)。HSP90在0.5～4 h一直維持較高水平的表達(dá)量(P<0.05)，8 h回落到基礎(chǔ)水平。HSF-1在熱應(yīng)激情況下基因表達(dá)升高顯著(P<0.05)。

表2不同時(shí)間熱處理對(duì)熱休克因子及熱休克蛋白基因表達(dá)的影響

Table 2Effects of different heat treatment time on the gene expression of heat shock factor and heat shock protein

項(xiàng)目Item處理時(shí)間/hTreatmenttime00.511.524812HSP271.00±0.12a0.50±0.13c0.35±0.04c0.49±0.13c0.53±0.28b0.35±0.06c0.38±0.09c0.28±0.09cHSP701.01±0.15d57.80±4.48c133.89±13.33b156.22±19.53ab188.86±31.89a74.62±21.27c14.68±7.03d59.27±55.26cHSP901.01±0.17b1.82±0.16a1.87±0.15a1.95±0.27a1.75±0.49a2.07±0.14a1.07±0.28b0.72±0.05bHSF-11.03±0.28c3.18±1.29ab3.38±0.59ab1.81±0.13bc3.36±0.10ab2.39±1.01ab1.13±0.15c3.30±0.53ab

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無(wú)字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同

Values in the same row with the same or no small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)，while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).The same as below

2.4不同時(shí)間熱處理對(duì)抗氧化基因表達(dá)的影響

不同時(shí)間熱處理對(duì)抗氧化基因表達(dá)的影響見(jiàn)表3。由表3可知，Keap1基因在熱應(yīng)激條件下表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)。Nrf2基因表達(dá)顯著上調(diào)，在高溫2 h表達(dá)量最高，隨后開(kāi)始下調(diào)，至8 h回落到基礎(chǔ)水平(P<0.05)。NQO1基因表達(dá)顯著上調(diào)，在高溫1 h表達(dá)量最高(P<0.05)，隨后開(kāi)始下降，但在高溫12 h內(nèi)始終高于基礎(chǔ)水平。

表3不同時(shí)間熱處理對(duì)抗氧化基因表達(dá)的影響

Table 3Effects of different heat treatment time on the gene expression of antioxidant

項(xiàng)目Item處理時(shí)間/hTreatmenttime00.511.524812Keap11.01±0.210.77±0.070.83±0.070.84±0.171.07±0.200.76±0.000.84±0.081.13±0.71Nrf21.01±0.18c1.10±0.34c1.11±0.16bc1.28±0.52bc2.59±0.67a1.70±0.28b0.91±0.16c1.35±0.34bcNQO11.06±0.46c2.01±0.40ab2.36±0.29a1.56±0.10bc1.45±0.23bc1.56±0.06bc1.42±0.60bc1.40±0.60bc

2.5不同時(shí)間熱處理對(duì)跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

不同時(shí)間熱處理對(duì)跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響見(jiàn)表4。由表4可知，高溫處理顯著降低跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體SLC7A5基因的表達(dá)(P<0.05)，SLC7A7基因在1 h及4 h表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。SLC38A2及SLC43A2基因表達(dá)在熱應(yīng)激條件下無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表4不同時(shí)間熱處理對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

Table 4Effects of different heat treatment time on the gene expression of transmembrane amino acid transporters

項(xiàng)目Item處理時(shí)間/hTreatmenttime00.511.524812SLC7A51.00±0.10a0.86±0.06b0.70±0.07c0.56±0.03d0.51±0.17d0.55±0.02d0.15±0.04e0.11±0.00eSLC7A71.01±0.20c1.07±0.09c1.12±0.14b0.91±0.02c0.73±0.15c1.66±0.69a0.75±0.10c0.73±0.02cSLC38A21.00±0.071.96±1.581.34±0.864.03±3.143.67±0.112.95±0.503.29±0.942.67±0.39SLC43A21.00±0.081.13±0.021.38±0.341.49±0.011.40±1.051.09±0.281.31±0.181.67±0.16

2.6不同時(shí)間熱處理對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

不同時(shí)間熱處理對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響見(jiàn)表5。由表5可知，GLUT1基因在熱應(yīng)激4～12 h表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)。GLUT8基因從0.5 h即開(kāi)始顯著下調(diào)，至8～12 h表達(dá)量達(dá)到最低(P<0.05)。GLUT12基因表達(dá)在0.5～2 h顯著上調(diào)，4～12 h顯著下調(diào)(P<0.05)。

表5不同時(shí)間熱處理對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

Table 5Effects of different heat treatment time on the gene expression of glucose transporters

項(xiàng)目Item處理時(shí)間/hTreatmenttime00.511.524812GLUT11.01±0.20a0.86±0.19ac0.92±0.11a0.87±0.21ab0.73±0.24ad0.59±0.15bcde0.41±0.18e0.41±0.12eGLUT81.01±0.19a0.49±0.21cde0.49±0.20ce0.49±0.10bde0.85±0.04ab0.58±0.24bc0.19±0.13f0.22±0.03defGLUT121.01±0.17cdf1.61±0.06bc1.82±0.24b2.52±0.91a1.75±0.37b0.60±0.19de0.18±0.13e0.39±0.11def

3　討　論

細(xì)胞暴露于高溫環(huán)境會(huì)引起細(xì)胞功能一系列異常現(xiàn)象，包括廣泛的蛋白合成抑制、蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變、細(xì)胞骨架重排造成的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、代謝轉(zhuǎn)變、細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變以及細(xì)胞增殖受阻[17]。L.Li等[[18]將奶牛乳腺上皮細(xì)胞于40.5 ℃高溫水浴制造熱應(yīng)激，30 min后于37 ℃恢復(fù)3～24 h，表明細(xì)胞活率在6 h達(dá)到最低，而后逐漸開(kāi)始增加，于18～24 h恢復(fù)到正常水平。胡菡等[7]將奶牛乳腺上皮細(xì)胞置于42 ℃高溫成功制造了熱應(yīng)激模型，本試驗(yàn)參照其方法，將奶牛乳腺上皮細(xì)胞置于42 ℃高溫，復(fù)制熱應(yīng)激模型。結(jié)果顯示，在0～1.5 h細(xì)胞活率持續(xù)降低，于2 h后開(kāi)始恢復(fù)，但均顯著低于正常水平，說(shuō)明熱應(yīng)激2 h后細(xì)胞逐漸適應(yīng)高溫環(huán)境，存活率短期內(nèi)不再下降。J.Du等[19]通過(guò)40 ℃ 1 h成功制造了奶牛乳腺上皮細(xì)胞熱應(yīng)激模型，表明高熱可通過(guò)降低線粒體膜電位觸發(fā)細(xì)胞凋亡及壞死途徑。本試驗(yàn)證明，高溫1.5 h可降低細(xì)胞線粒體膜電位，后者觸發(fā)的細(xì)胞凋亡途徑可能是導(dǎo)致細(xì)胞活率顯著降低的重要原因。

細(xì)胞熱應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)高度保守的蛋白激活和基因表達(dá)改變級(jí)聯(lián)反應(yīng)，該網(wǎng)絡(luò)中的基因表達(dá)受到HSF的調(diào)節(jié)[20]。HSF家族普遍存在于真菌、果蠅、禽類(lèi)、人類(lèi)等多種生物體內(nèi)，且具有廣泛的同源性，被證明是細(xì)胞溫度升高的最重要的第一反應(yīng)物[21]，轉(zhuǎn)錄因子與細(xì)胞對(duì)熱應(yīng)激的反應(yīng)相協(xié)同，影響包括HSP在內(nèi)的一系列基因的表達(dá)[22]。奶牛HSF1基因定位于14號(hào)染色體，由525個(gè)氨基酸組成，包括DNA結(jié)合域、三聚區(qū)域、調(diào)節(jié)域和轉(zhuǎn)錄活化域4部分[23]。HSP是在各種應(yīng)激條件下產(chǎn)生的分子伴侶，在細(xì)胞保護(hù)中的中心作用體現(xiàn)在其對(duì)抗高溫引起的循環(huán)休克和腦缺血[24]。

泌乳期奶牛對(duì)高溫尤其敏感，R.J.Collier等[25]以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型證明，在高溫開(kāi)始階段(42 ℃)，牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化(導(dǎo)管分支退化)，細(xì)胞生長(zhǎng)減弱，隨后，基因轉(zhuǎn)錄與蛋白合成及細(xì)胞代謝下降，在這一模型系統(tǒng)中，HSP70基因維持了4 h的高表達(dá)，8 h后恢復(fù)基礎(chǔ)水平，標(biāo)志著耐熱信號(hào)的終止和凋亡相關(guān)基因的激活。隨后，R.J.Collier等[26]明確提出提高或者延長(zhǎng)熱休克應(yīng)答能夠改善細(xì)胞對(duì)高溫的耐受能力。與此相一致，K.Dokladny等[27]發(fā)現(xiàn)MDCK上皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)HSP70同樣可以提高熱耐受。本試驗(yàn)證明，42 ℃高溫處理可顯著提高HSP70的基因表達(dá)，并在2 h其表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量逐漸降低，但始終顯著高于基礎(chǔ)水平。HSP90在0.5～4 h一直維持較高水平的表達(dá)量，8～12 h回落到基礎(chǔ)水平。HSP27隨著熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)量顯著降低。HSF-1在熱應(yīng)激情況下基因表達(dá)總體升高。HSP70在1～2 h之內(nèi)表達(dá)量升高至百倍，HSP90在1～4 h表達(dá)量增加1倍左右，而細(xì)胞活率在1.5～2 h后不再降低，說(shuō)明隨著高溫時(shí)間延長(zhǎng)，其耐熱能力增強(qiáng)，細(xì)胞死亡率降低，推測(cè)HSP70和HSP90高表達(dá)提高了細(xì)胞對(duì)于高溫的耐受能力。胡菡等[7]的試驗(yàn)中，熱應(yīng)激0～24 h 對(duì)HSP27基因的表達(dá)無(wú)顯著影響，而本試驗(yàn)中HSP27隨熱應(yīng)激延長(zhǎng)表達(dá)量持續(xù)下降，可能是由于所選用細(xì)胞代數(shù)不同，其對(duì)高溫的耐受程度不同所造成，但其降低的具體原因還有待深入研究。

熱應(yīng)激會(huì)引起動(dòng)物體溫上升，體溫升高會(huì)影響機(jī)體內(nèi)代謝酶的活性，使機(jī)體代謝率升高，高代謝率會(huì)增加自由基的產(chǎn)生，自由基會(huì)和許多生物大分子反應(yīng)，如脂質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸，過(guò)多的自由基會(huì)打破機(jī)體氧化和抗氧化的平衡系統(tǒng)，造成脂質(zhì)的過(guò)氧化，引起蛋白質(zhì)和DNA的損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[28]。宋小珍等[29]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激導(dǎo)致肉牛機(jī)體產(chǎn)生了明顯的氧化損傷。Nrf2是調(diào)控氧化應(yīng)激基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，正常生理?xiàng)l件下，Keap1與Nrf2相互結(jié)合，抑制Nrf2從胞漿進(jìn)入胞核內(nèi)激活下游ARE信號(hào)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1與Nrf2解偶聯(lián)，Nrf2轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，與基因中的小Maf 蛋白結(jié)合成異二聚體后識(shí)別并結(jié)合ARE，啟動(dòng)下游抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞抗氧化能力[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Nrf2及下游抗氧化基因NQO1隨著熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)量均有不同程度的升高，推測(cè)高溫造成了奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，激活了Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路，使抗氧化基因表達(dá)上調(diào)。

AA通過(guò)幾種特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入乳腺上皮細(xì)胞，1985年，C.R.Baumrucker 初步闡明了奶牛乳腺組織中的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(Amino acid transporters，AATs) 的功能特性[31]。1998年，基于離子依賴(lài)性和底物特異性，至少已鑒定出6個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，包括Na+依賴(lài)性的A、ASC、XAG，N系統(tǒng)和非Na+依賴(lài)性的L和y+系統(tǒng)[32]，形成了6個(gè)溶質(zhì)載體(Solute carrier，SLC)基因超家族：SLC1、SLC6、SLC7、SLC36、SLC38及SLC43家族及一個(gè)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC16。特定的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體不僅能夠跨膜運(yùn)輸氨基酸，而且這些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體能夠通過(guò)mTORC1影響蛋白代謝[33]。某些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體還具有“轉(zhuǎn)運(yùn)感受器(Transceptors)” 的功能，它位于胞內(nèi)信號(hào)上游，能夠感受細(xì)胞內(nèi)外氨基酸濃度。J.Pinilla等[34]研究顯示，降低細(xì)胞氨基酸供給，氨基酸結(jié)合到中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體SNAT2時(shí)，或者氨基酸流經(jīng)過(guò)SNAT2時(shí)，可改變SNAT2的構(gòu)象，從而觸發(fā)激活mTORC1的層疊信號(hào)。因此，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體在介導(dǎo)氨基酸與mTORC1信號(hào)通路及調(diào)控蛋白代謝過(guò)程中起了重要作用。

SLC7A5編碼的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體LAT1，與SLC3A2編碼的4F2hc載體(CD98)相結(jié)合形成的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)異二聚體可將苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、亮氨酸以及色氨酸等長(zhǎng)鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)，同時(shí)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，該雙向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程為氨基酸激活mTOR通路的限速步驟[35]，mTOR通路可進(jìn)一步調(diào)控乳蛋白合成過(guò)程。中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體SNAT2由SLC38A2編碼，近期研究表明，SNAT2與LAT1-CD98相偶聯(lián)，亮氨酸濃度增加后可通過(guò)該偶聯(lián)激活mTOR通路[36]。SLC7A7編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)載體可將陽(yáng)離子氨基酸及一些長(zhǎng)鏈氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，該基因缺乏可導(dǎo)致賴(lài)氨酸尿性蛋白不耐受[6]。本試驗(yàn)顯示，熱應(yīng)激可顯著下調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞SLC7A5基因表達(dá)。SLC7A7基因表達(dá)在42 ℃高溫1.5 h及4 h表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。SLC38A2和SLC43A1基因表達(dá)受高熱處理后基因表達(dá)無(wú)顯著差異 。該結(jié)果表明，奶牛乳腺上皮細(xì)胞各個(gè)家族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體受高熱處理后基因表達(dá)變化不一致，推測(cè)熱應(yīng)激條件下奶牛乳腺上皮細(xì)胞通過(guò)影響跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)改變其對(duì)血液中游離氨基酸的攝取進(jìn)而改變?nèi)榈鞍椎暮铣伞?/p>

葡萄糖是乳糖合成的重要前體物，是乳中的重要固形物，能夠滲透性調(diào)節(jié)乳產(chǎn)量[37]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體(GLUTs)是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的一類(lèi)功能性蛋白，其主要作用為跨膜運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)外的葡萄糖，其中，GLUT1是乳腺組織中最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體，其對(duì)于乳腺組織乳糖的合成有重要的意義[13]。懷孕后期至泌乳前期GLUT1、GLUT8、GLUT12基因表達(dá)增加5倍到數(shù)百倍不等，表明其對(duì)乳腺發(fā)育及泌乳的維持必不可少[38]。本試驗(yàn)表明，熱應(yīng)激可不同程度降低GLUT1和GLUT8基因的表達(dá)量，GLUT12基因表達(dá)在熱應(yīng)激0～2 h表達(dá)量顯著升高，4～12 h顯著降低。乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)顯示，GLUT1和GLUT12表達(dá)增加可顯著上調(diào)SLC1A5、SLC3A2、SLC7A5的基因表達(dá)[39]，表明乳腺上皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)可影響跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)。熱應(yīng)激條件下跨膜氨基酸及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的改變可能與高溫造成細(xì)胞膜流動(dòng)性改變，細(xì)胞膜重新排列有關(guān)[40]，但其具體機(jī)制目前尚不明確。

4　結(jié)　論

夏季高溫持續(xù)時(shí)間過(guò)久引起的熱應(yīng)激給奶牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，尤其嚴(yán)重地影響了奶牛的泌乳性能。本試驗(yàn)以奶牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，證明熱應(yīng)激可顯著降低細(xì)胞活率，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激。HSF-1分子及HSPs對(duì)熱應(yīng)激反應(yīng)敏感，可能提高細(xì)胞的耐熱能力?？缒ぐ被徂D(zhuǎn)運(yùn)載體及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)也發(fā)生了改變，推測(cè)熱應(yīng)激條件下乳糖及乳蛋白合成下調(diào)與跨膜氨基酸及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)有關(guān)。

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(編輯郭云雁)

Heat Stress-induced Cell Injury and Effects on the Gene Expression of Milk Synthesis-related Transporters in Dairy Cow

QUAN Su-yu1，2，ZHANG Yuan-shu1*，BU Deng-pan2，3，4*

(1.TheAnimalPhysiologyandBiochemistryLaboratoryoftheMinistryofAgriculture，NanjingAgricultureUniversity，Nanjing210095，China；2.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition，InstituteofAnimalScience，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100193，China；3.CAAS-ICRAFJointLaboratoryonAgroforestryandSustainableAnimalHusbandry，Beijing100193，China；4.SynergeticInnovationCenterofFoodSafetyandNutrition，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Bovine mammary epithelial cell was chosen as the model to find the factors impairing lactation performance of dairy cow during heat stress.Cell vitality，mitochondrial membrane potential and the expression of genes related to heat shock molecule and proteins，oxidative stress，amino acids and glucose transporters were detected in the bovine mammary epithelial cells treated for 0，0.5，1，1.5，2，4，8 and 12 h at 42 ℃，respectively.The result showed that different heat treatment time significantly reduced mammary epithelial cell vitality (P<0.05) and damaged mitochondrial membrane potential.The expression ofHSP27 decreased significantly (P<0.05)，whileHSP70 increased significantly (P<0.05).The expression ofHSP90 increased significantly in 0-4 h (P<0.05)，and returned to normal level after then.The expression ofHSF-1 increased significantly in some time points (P<0.05).The gene expression of Keach like ECH-associated protein-1 (Keap1) showed no significant difference(P>0.05)，while nuclear factor-E2-related factor 2 (Nrf2) and NAD (P) H dehydrogenase quinone-1 (NQO1) increased significantly (P<0.05).The gene expression of transmembrane amino acid transporterSLC7A7 increased significantly in 1 h and 4 h(P<0.05).The gene expression of glucose transportersGLUT1 andGLUT8 decreased significantly (P<0.05).The expression of glucose transporterGLUT12 increased significantly during 0-2 h，and decreased significantly during 4-12 h (P<0.05).In conclusion，heat stress could significantly reduce the cell vitality，cause oxidative stress，change the gene expression of heat shock proteins and molecule and membrane transport carriers.

heat stress；bovine mammary epithelial cell；cell vitality；mitochondrial membrane potential；oxidative stress；heat shock protein；membrane transport carriers

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.023

2015-09-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372341)；“十二五”科技支撐計(jì)劃(2012BAD12B02-5)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)

權(quán)素玉(1989-)，女，河北平山人，碩士生，主要從事反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究， E-mail:1203457176@qq.com

張?jiān)词?，教授，E-mail:zhangyuanshu@sina.com；卜登攀，研究員，E-mail:budengpan@126.com

S852.23

A

0366-6964(2016)08-1704-10