楊丹麗，張迎秋，李　媛，秦勝堂

(大連醫(yī)科大學(xué) 腫瘤干細(xì)胞研究院，遼寧 大連 116044)

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冬凌草甲素對甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞增殖的抑制作用

楊丹麗，張迎秋，李媛，秦勝堂

(大連醫(yī)科大學(xué) 腫瘤干細(xì)胞研究院，遼寧 大連 116044)

目的研究冬凌草甲素對甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞增殖的抑制作用。方法使用0、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L濃度的冬凌草甲素處理甲狀腺癌細(xì)胞株BCPAP 48 h后，用CCK8測定細(xì)胞增殖率，繪制增殖曲線，計算細(xì)胞半數(shù)抵制率(IC50)。實驗組加入接近IC50濃度(10 μmol/L)的冬凌草甲素，對照組細(xì)胞正常培養(yǎng)36 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，利用Western blot檢測凋亡基因PARP、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的表達。結(jié)果冬凌草甲素能顯著抑制BCPAP細(xì)胞增殖，在2～20 μmol/L時，具有明顯的量效關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組細(xì)胞早期凋亡率(2.83±0.70)%，晚期凋亡率(1.43±0.31)%，總凋亡率(4.27±1.01)%，均明顯升高(P<0.05)。Western blot發(fā)現(xiàn)，剪切后的PARP及p-Erk蛋白的表達水平分別上調(diào)了1.5倍和1.8倍，上調(diào)顯著(P值均<0.05)。結(jié)論冬凌草甲素可抑制甲狀腺癌細(xì)胞株BCPAP增殖，其可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

冬凌草甲素；甲狀腺癌細(xì)胞株BCPAP；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

[引用本文]楊丹麗，張迎秋，李媛,等.冬凌草甲素對甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞增殖的抑制作用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016,38(4)：330-333.

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1%。甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌癥中最常見的組織類型，是典型的分化良好型腫瘤，治愈率高而且預(yù)后良好[1-2]。然而侵襲性甲狀腺乳頭狀腫瘤和一些該腫瘤的變異型仍會導(dǎo)致10%左右的病人10年內(nèi)病情復(fù)發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移，所以盡管乳頭狀甲狀腺癌分化良好[3]，但仍能發(fā)生轉(zhuǎn)移而且存在一定的抗藥性，因此針對這種惡性腫瘤的治療方法還需要突破[4]。近期文獻報道冬凌草甲素具有極強的抗腫瘤作用[5-7]，但是它對于甲狀腺癌的作用少有報道。本研究擬探討冬凌草甲素對甲狀腺癌細(xì)胞株BCPAP增殖的影響,希望為甲狀腺癌的相關(guān)治療提供幫助。

1　材料和方法

1.1主要試劑與儀器

冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)品購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；人甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞株為大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤干細(xì)胞研究院劉強課題組惠贈；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物；冬凌草甲素用1 mL DMSO溶解后加入9 mL ddH2O，配制成含10%DMSO濃度為10 mmol/L的儲液，4 ℃保存，使用時用培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度，對照組為含相應(yīng)含量DMSO的培養(yǎng)基。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)所需DMEM培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清均購自Gibco公司。

細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM。0.05%胰酶消化傳代。

1.3CCK8測定細(xì)胞增殖率

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×104/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，過夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。24 h后分別新鮮加入含0(對照組)、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L冬凌草甲素的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，吸棄培養(yǎng)基，按照試劑盒說明書向每孔中加入10 μL CCK8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度。將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加10 μL CCK8溶液，無細(xì)胞)后，計算細(xì)胞增殖率：增殖率=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

使用凱基生物的Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105/mL，將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁吸棄培養(yǎng)基，實驗組加入含10 μmol/L冬凌草甲素的培養(yǎng)液2 mL，對照組加入含0.2 μLDMSO的培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)36 h。0.05%胰酶消化后，取(1～5)×105個重懸的細(xì)胞1000 g離心5 min后棄上清，按說明書分別加入500 μL binding buffer重懸，5 μL Annexin V輕輕混勻，及5 μL PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，進行流式細(xì)胞儀檢測。

1.5Western blot實驗

收集相應(yīng)10 μmol/L冬凌草甲素處理36 h的實驗組細(xì)胞和DMSO處理36 h的對照組細(xì)胞裂解提取蛋白。以10%SDS-PAGE膠分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移膜。5%脫脂奶粉封閉后分別以不同的抗體(DNA修復(fù)酶PARP/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶erk1/2及p-erk1/2，根據(jù)抗體說明書1∶1000稀釋)4 ℃孵育過夜，洗去一抗后，以辣根過氧化物酶(HRP)連接的二抗室溫孵育1 h，洗滌，ECL試劑盒顯示條帶，β-actin作為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)　果

2.1冬凌草甲素對BCPAP細(xì)胞體外增殖作用的影響

冬凌草甲素作用于BCPAP細(xì)胞系48 h后，細(xì)胞增殖率曲線可見冬凌草甲素濃度在2～20 μmol/L時，濃度越高細(xì)胞增殖率越低，具有明顯的量效關(guān)系。見圖1。其細(xì)胞半數(shù)抑制率(IC50)為10.49 μmol/L，隨著冬凌草甲素濃度的進一步增加，BCPAP細(xì)胞系的增殖率明顯下降，最終接近于停止。

圖1　不同濃度冬凌草甲素(0～100 μmol/L)作用于BCPAP細(xì)胞48 h后的增殖曲線Fig 1 The proliferation curve of different concentrations of Oridonin (0-100 μmol/L)on BCPAP cell after 48 h

2.2流式細(xì)胞儀結(jié)果分析

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均升高(t分別為18.59,4.61,12.87)，尤其是早期凋亡組變化更為顯著，差異均有顯著性意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表 1冬凌草甲素對BCPAP細(xì)胞凋亡的影響

Tab 1 Effect of oridonin inducing apotosis of BCPAP cells(%)

早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率對照組2.83±0.701.43±0.31 4.27±1.01實驗組34.87±3.031)4.40±0.661)39.27±3.611)

1)與對照組比較，P<0.05

圖2　冬凌草甲素對BCPAP細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Oridonin induces the apoptosis of BCPAP cellsA:對照組；B:實驗組

2.3PARP和Erk1/2的表達

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組被剪切PARP和磷酸化Erk1/2的表達上調(diào)，根據(jù)灰度值比較分析，剪切后的PARP及p-Erk的表達水平分別上調(diào)了1.5倍和1.8倍，上調(diào)顯著(P值均<0.05)。見圖3。

圖3　凋亡相關(guān)蛋白表達水平Fig 3 Expression levels of apoptosis-related proteins

3　討　論

冬凌草甲素是植物冬凌草中的一種四環(huán)二萜化合物，是冬凌草中的主要活性成分[8]。近年來中藥活性成分治療腫瘤成為研究的熱點之一[9]。已有許多文獻報道冬凌草甲素對多種腫瘤具有殺傷作用[10-11]，但是它對于甲狀腺癌的作用還無從得知。本研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素可顯著抑制甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞株的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

本研究采用不同濃度的冬凌草甲素作用于BCPAP細(xì)胞48 h，發(fā)現(xiàn)濃度在2～20 μmol/L時，隨著濃度的增加，冬凌草甲素對BCPAP的增殖抑制作用增強，具有明顯的濃度依賴性。采用接近IC50的濃度(10 μmol/L)進行后續(xù)研究，探討冬凌草甲素抑制細(xì)胞增殖的機制。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)AV-PI雙染的方法檢測了冬凌草甲素作用于甲狀腺癌細(xì)胞株BCPAP 36 h后細(xì)胞凋亡比率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組細(xì)胞凋亡比例顯著升高，尤其早期凋亡的比例更為顯著，這提示冬凌草甲素可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡來抑制增殖。本研究利用western blot檢測了冬凌草甲素作用后，凋亡相關(guān)蛋白及通路核心分子的變化。結(jié)果表明冬凌草甲素的加入明顯上調(diào)了被剪切PARP及p-Erk的蛋白水平，而并不改變total Erk的蛋白表達，這與Erk磷酸化之后發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是一致的。這一結(jié)果有助于進一步探討其作用機制。

總之，本研究顯示冬凌草甲素可抑制甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞增殖，其機制可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。今后將進一步深入探討其對腫瘤抑制作用的機制和對細(xì)胞周期的影響，為甲狀腺癌的臨床治療提供實驗基礎(chǔ)。

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Study of Oridonin inhibiting proliferation of thyroid carcinoma cell line BCPAP

YANG Dan-li, ZHANG Ying-qiu, LI Yuan, QIN Sheng-tang

(InstituteofCancerStemCell,DalianMedicalUniversity，Dalian116044，China)

Objective To investigate the mechanism of Oridonin on proliferation of BCPAP thyroid carcinoma. Methods Thyroid carcinoma cell line BCPAP was treated 48 h with Oridonin. CCK8 method was used to detect cell proliferation rate, flow cytometry used in apoptosis analysis and western blot method used to detect PARP and Erk1/2 expression. SAS 9.3 software was used in statistical analysis. Results Oridonin inhibited proliferation of BCPAP thyroid carcinoma significantly and had dose-dependent in middle-level concentration (2-20 μmol/L).The cells treated with oridonin showed higher apoptosis frequency than those non-treated (P<0.05). Spliced PARP and p-Erk1/2 expression increased in cells treated with oridonin. Conclusion Oridonin would inhibit proliferation of BCPAP by induction cell apoptosis.

Oridonin; thyroid carcinoma cell line BCPAP; cell proliferation; cell apoptosis

楊丹麗(1987-)，女，河南商丘人，助理實驗師。E-mail：ydanli963@163.com

秦勝堂，助理實驗師。E-mail：qinlang8188@163.com

論著10.11724/jdmu.2016.04.04

R736.1

A

1671-7295(2016)04-0330-04

2015-12-05;

2016-04-06)