林佳寧, 顏 天, 張清春, 王云峰, 劉 青, 周名江

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福建沿海米氏凱倫藻赤潮對(duì)皺紋盤(pán)鮑鰓組織抗氧化酶活性的影響研究

林佳寧1, 2, 顏 天1, 張清春1, 王云峰1, 劉 青1, 周名江1

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院 流域水生態(tài)保護(hù)技術(shù)研究室, 北京 100012)

本文初步研究了在較低赤潮密度(低于107個(gè)/mL)下, 一株米氏凱倫藻()對(duì)皺紋盤(pán)鮑()鰓內(nèi)幾種抗氧化酶, 如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)的毒性效應(yīng), 以期分析米氏凱倫藻對(duì)鮑魚(yú)生命活動(dòng)可能的脅迫方式。研究表明, 米氏凱倫藻對(duì)SOD、CAT酶活性均造成不利影響, 并未對(duì)GSH-Px酶造成不利影響, 其酶活性顯著高于對(duì)照組。米氏凱倫藻對(duì)SOD酶活性的影響表現(xiàn)為“先誘導(dǎo)后抑制”效應(yīng), 24 h內(nèi), 各處理組(0.1個(gè)/mL, 0.5個(gè)/mL, 1.0×104個(gè)/mL)中, 酶活性急劇增高, 分別是對(duì)照組的1.2, 1.3, 1.3倍, 之后酶活性迅速下降, 分別是對(duì)照組的77%, 77%, 73%。SOD能夠清除機(jī)體體內(nèi)多余的自由基, 其活力變化反映了機(jī)體抵制自由基損傷能力已受到明顯抑制。此外, 米氏凱倫藻處理組中, CAT酶活性則處于“被抑制”狀態(tài), 48 h內(nèi)酶活性持續(xù)下降, 分別降低至對(duì)照組的58%, 51%, 37%。CAT可以清除SOD歧化超氧陰離子自由基產(chǎn)生的H2O2, 其活力的下降也可能造成機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化物的累積及氧化損傷。結(jié)果表明, 即使未達(dá)到較高赤潮密度(不超過(guò)107個(gè)/mL)時(shí), 米氏凱倫藻短時(shí)間內(nèi)仍可對(duì)鮑魚(yú)鰓內(nèi)關(guān)鍵抗氧化酶活性造成顯著抑制效應(yīng), 這極有可能導(dǎo)致鮑魚(yú)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)遭受嚴(yán)重?fù)p傷。

米氏凱倫藻(); 皺紋盤(pán)鮑(); 鰓; 抗氧化酶; 酶活性

2012年春夏季(5月至6月), 福建近岸海域發(fā)生多起大規(guī)模的米氏凱倫藻()赤潮災(zāi)害, 赤潮發(fā)生期間, 米氏凱倫藻藻細(xì)胞密度高達(dá)107個(gè)/L, 部分海域赤潮持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)21 d。該赤潮造成海上養(yǎng)殖鮑魚(yú)大面積死亡, 對(duì)平潭、惠安、福清、莆田、福州等地鮑魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重[1], 造成總經(jīng)濟(jì)損失達(dá)20.11億元[2], 為世界上目前報(bào)道的赤潮經(jīng)濟(jì)損失之最。

米氏凱倫藻赤潮在世界沿海廣泛存在, 是一類典型的魚(yú)毒性赤潮, 能在幾小時(shí)之內(nèi)造成魚(yú)類大量死亡。然而, 2012年福建沿海的米氏凱倫藻赤潮卻對(duì)鮑魚(yú)造成了巨大的殺傷性, 引起了普遍的關(guān)注。已有研究表明, 米氏凱倫藻對(duì)貝類生命活動(dòng)能產(chǎn)生一定的影響, 如導(dǎo)致紫貽貝、長(zhǎng)牡蠣清濾率下降[3]; 降低海灣扇貝D形幼蟲(chóng)的活力; 導(dǎo)致底棲貽貝、牡蠣、蛤類的死亡等[4-7]。2012年米氏凱倫藻赤潮作為鮑魚(yú)的“殺手”, 室內(nèi)研究表明, 較高的赤潮密度下(2.0, 3.0×104個(gè)/mL), 米氏凱倫藻可導(dǎo)致鮑魚(yú)48 h內(nèi)死亡率高于50%, 然而, 米氏凱倫藻對(duì)鮑魚(yú)生命活動(dòng)的脅迫方式如何, 目前仍鮮有研究。

以往研究發(fā)現(xiàn), 許多有害甲藻, 如鏈狀裸甲藻、塔瑪亞歷山大藻等可以導(dǎo)致貝類組織內(nèi)抗氧化酶系的活性改變, 致使動(dòng)物機(jī)體因活性氧過(guò)量積累而對(duì)生物體造成損傷, 甚至死亡[8-10]?；钚匝鯐?huì)引起生物體內(nèi)酶變性、多聚糖解聚、DNA損傷, 進(jìn)而導(dǎo)致遺傳改變[11], 還可能導(dǎo)致脂類分子過(guò)氧化, 從而破壞生物膜的完整性。已有研究表明, 米氏凱倫藻可以產(chǎn)生超氧陰離子和過(guò)氧化氫, 能夠通過(guò)氧化細(xì)胞膜的膜脂, 對(duì)生物造成氧化損傷[12]。因此, 米氏凱倫藻赤潮發(fā)生時(shí), 其是否會(huì)對(duì)鮑魚(yú)機(jī)體造成氧化損傷, 目前尚不清楚。

生物體的抗氧化防御系統(tǒng)在清除活性氧物質(zhì), 減少細(xì)胞氧化損傷方面發(fā)揮著重要作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)被認(rèn)為是水生生物體內(nèi)去除活性氧的最重要的酶類[13]。在水生動(dòng)物中, 鰓是水體污染物發(fā)揮毒性作用的最初位點(diǎn), 具有氣體交換、離子和酸堿調(diào)節(jié)、氮排泄以及解毒功能。本文通過(guò)室內(nèi)實(shí)驗(yàn), 模擬了較低赤潮密度下(不超過(guò)107個(gè)/L), 米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑鰓抗氧化酶系的影響, 力求分析米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑生命活動(dòng)可能的脅迫方式。

1 材料與方法

1.1 材料

米氏凱倫藻()由廈門(mén)大學(xué)王大志教授課題組提供, 分離自2012年福建米氏凱倫藻赤潮發(fā)生區(qū)域, 以f/2培養(yǎng)液?jiǎn)畏N培養(yǎng), 光暗比為14L︰10D, 光照強(qiáng)度約為3000 lx。用于藻類培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)的海水為來(lái)自青島第二海水浴場(chǎng)經(jīng)沙濾過(guò)后的自然海水, 使用前經(jīng)0.45 μm混合纖維濾膜過(guò)濾并高溫消毒, 水溫19℃±0.5℃, 鹽度30±1。供試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皺紋盤(pán)鮑由青島市膠南福海生海珍品有限公司提供, 經(jīng)篩選后選規(guī)格一致的幼鮑(殼長(zhǎng): 2.0~2.5cm)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)100 L海水水槽中暫養(yǎng)7 d, 暫養(yǎng)期間充分曝氣, 每天投喂新鮮海帶。用于鮑魚(yú)室內(nèi)暫養(yǎng)的海水未經(jīng)0.45 μm混合纖維濾膜過(guò)濾與高溫消毒, 其他條件與藻類培養(yǎng)海水一致。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)容器為3 L玻璃燒杯, 實(shí)驗(yàn)體積為2.5 L。取指數(shù)生長(zhǎng)中期的藻液, 0.5 mL計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)后用海水稀釋, 使藻細(xì)胞數(shù)量分別達(dá)到預(yù)設(shè)梯度(0.1個(gè)/mL, 0.5個(gè)/mL, 1.0×104個(gè)/mL), 以無(wú)菌海水作為實(shí)驗(yàn)藻液的空白對(duì)照。挑選暫養(yǎng)后健康的幼鮑隨機(jī)加入燒杯中, 每杯10只, 將稀釋好的藻液加入到燒杯, 每個(gè)處理組包含9個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)在恒溫條件下進(jìn)行, 溫度為19℃±0.5℃, 鹽度30±1, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行均勻曝氣處理( DO濃度7.0~8.0 mg/L), pH為7.5~8.2, 水體中氨氮濃度為0.004~0.084 mg/L(能維持貝類正常生存)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)48 h, 每隔24 h更換一次培養(yǎng)液, 以保證較為準(zhǔn)確的藻濃度, 實(shí)驗(yàn)中未給鮑魚(yú)投喂餌料。同時(shí), 觀察鮑魚(yú)的存活情況, 幼鮑中毒后多次刺激無(wú)反應(yīng)判斷為死亡, 并從燒杯中撈出。實(shí)驗(yàn)第0, 24, 48 h時(shí)采樣, 每個(gè)處理組隨機(jī)采集9只鮑魚(yú), 分離出鰓樣品, 用蒸餾水沖洗干凈后置于凍存管中, 于–80℃超低溫冰箱中保存。樣品測(cè)定前解凍, 加入預(yù)冷的磷酸緩沖液(比例1︰9), 冰浴中勻漿, 之后4℃離心30 min, 5000 r/min, 取上清液進(jìn)行酶活性分析。

SOD、CAT、GSH-Px酶活性測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒, 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。SOD活性單位定義為: 每毫克組織蛋白中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。CAT活性單位定義為: 每毫克組織蛋白每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為一個(gè)活力單位。GSH-Px活性單位定義為: 規(guī)定每毫克組織蛋白在37℃反應(yīng)5 min, 扣除非酶促反應(yīng)作用, 使反應(yīng)體系中GSH-Px濃度降低1mol/L為一個(gè)酶活力單位。蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 16.0以及ORIGIN 8.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖, 利用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn), 顯著性檢驗(yàn)的置信度水平為0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑48h內(nèi)存活率的影響

圖1為不同藻細(xì)胞密度下(0.1個(gè)/mL, 0.5個(gè)/mL, 1.0×104個(gè)/mL)米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑48 h內(nèi)存活率的影響。結(jié)果表明, 48 h內(nèi), 各個(gè)處理組鮑魚(yú)均保持較高的存活率。0.1個(gè)/mL、0.5×104個(gè)/mL米氏凱倫藻處理組中, 鮑魚(yú)存活率高達(dá)100%, 未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。1.0×104個(gè)/mL米氏凱倫藻處理組中, 鮑魚(yú)48 h內(nèi)存活率仍接近80%。

2.2 米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑48h內(nèi)SOD酶活性的影響

圖2為不同米氏凱倫藻藻細(xì)胞密度下, 皺紋盤(pán)鮑48h鰓內(nèi)SOD酶活性的變化, SOD酶活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)。24h時(shí), 各個(gè)密度米氏凱倫藻(0.1個(gè)/mL, 0.5個(gè)/mL, 1.0×104個(gè)/mL)處理組中, SOD酶活性均顯著高于對(duì)照組(<0.05), 分別增高至對(duì)照組的1.24, 1.29, 1.33倍, 表明此時(shí)酶活性一直處于被誘導(dǎo)狀態(tài)。48 h時(shí), SOD酶活性顯著下降(<0.05), 分別降至對(duì)照組的77.34%, 77.41%, 72.82%, 表明此時(shí)酶活性處于明顯被抑制的狀態(tài)。由此說(shuō)明, 較短時(shí)間內(nèi)(48 h), 米氏凱倫藻雖對(duì)鮑魚(yú)存活率影響不大, 但可顯著抑制鮑魚(yú)鰓內(nèi)SOD酶活性, 造成機(jī)體氧化損傷。

2.3 米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑48h內(nèi)CAT酶活性的影響

圖3 為不同藻細(xì)胞密度下, 米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑48 h內(nèi)CAT酶活性的影響。48 h內(nèi), 各個(gè)密度米氏凱倫藻(0.1個(gè)/mL, 0.5個(gè)/mL, 1.0 ×104個(gè)/mL)處理組中, CAT酶活性顯著低于對(duì)照組(<0.05), 且隨時(shí)間延長(zhǎng), CAT酶活性持續(xù)下降。48 h時(shí), CAT酶活性分別降至與對(duì)照組的58.24%, 51.37%, 37.42%, 由此說(shuō)明, 米氏凱倫藻(0.1~1.0×104個(gè)/mL)短時(shí)間內(nèi), 能夠顯著抑制鮑魚(yú)鰓內(nèi)CAT酶活性。

2.4 米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑48h內(nèi)GSH-Px酶活性的影響

圖4 為不同藻細(xì)胞密度下, 米氏凱倫藻對(duì)皺紋盤(pán)鮑48h內(nèi)GSH-Px酶活性的影響。各米氏凱倫藻處理組中, GSH-Px酶活性均表現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 各處理組內(nèi)GSH-Px酶活性顯著高于對(duì)照組(<0.05), 表明GSH-Px酶活性一直處于被誘導(dǎo)狀態(tài)。48 h時(shí), 各處理組中GSH-Px酶活性增至最高值, 分別為對(duì)照組的1.73倍、1.58倍、1.76倍。由此說(shuō)明, 米氏凱倫藻短時(shí)間內(nèi)不會(huì)對(duì)鮑魚(yú)鰓中GSH-Px酶活性造成不利影響。

3 討論

據(jù)報(bào)道, 在毒性物質(zhì)脅迫下, 生物體內(nèi)的抗氧化酶變化呈現(xiàn)“鐘型”趨勢(shì)[14], 即短時(shí)間內(nèi)酶活性經(jīng)歷先被激活后被抑制的變化趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn), 各個(gè)米氏凱倫藻處理組中, 鮑魚(yú)鰓內(nèi)SOD酶活性均表現(xiàn)為“先誘導(dǎo)后抑制”效應(yīng)。SOD是催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)的一類金屬酶, 能夠?qū)Ⅲw內(nèi)超氧陰離子(O2–)轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫(H2O2), 是機(jī)體防御過(guò)氧化損傷的關(guān)鍵酶。前24 h內(nèi), SOD酶活性急劇增高, 說(shuō)明實(shí)驗(yàn)體系中有大量活性氧產(chǎn)生, 機(jī)體為減輕活性氧造成的氧化損傷, 誘導(dǎo)SOD酶活力上升, 機(jī)體內(nèi)O2–在SOD的催化下轉(zhuǎn)化為H2O2。24 h后SOD酶活性急劇下降, 最終顯著低于正常水平, 可能是機(jī)體內(nèi)活性氧自由基大量增加, 超過(guò)了機(jī)體的清除能力, 組織受到活性氧的攻擊而受損, 影響了細(xì)胞合成SOD的能力, 導(dǎo)致其活力下降。

為清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的大量H2O2, 機(jī)體需激活CAT、GSH-Px合成途徑。CAT可以清除SOD歧化超氧陰離子自由基產(chǎn)生的H2O2, 米氏凱倫藻處理組中, CAT酶活性均表現(xiàn)為持續(xù)下降的趨勢(shì), 可能也是由于機(jī)體內(nèi)活性氧自由基及過(guò)氧化氫均大量累積超過(guò)一定限度, 導(dǎo)致組織因受氧化損傷而影響了CAT酶的合成。GSH-Px也是一種過(guò)氧化物酶, 能夠催化H2O2氧化其他底物后生成H2O和O2, 米氏凱倫藻處理組中GSH-Px處于被誘導(dǎo)狀態(tài), 可能由于生物體內(nèi)CAT含量降低時(shí), GSH-Px能代替CAT清除H2O2。目前, 已有研究表明, 部分甲藻或甲藻毒素可以造成生物體抗氧化系統(tǒng)的損傷, 抑制抗氧化酶的活性。例如, 鏈狀裸甲藻可以顯著抑制扇貝鰓內(nèi)SOD、CAT酶活性[8], GTX2/3毒素可以導(dǎo)致小鼠肝臟內(nèi)SOD酶活性下降[15], 塔瑪亞歷山大藻可導(dǎo)致扇貝消化腺、閉殼肌組織內(nèi)SOD、CAT酶活性的下降[10]。由此可見(jiàn), 本研究中未達(dá)到較高赤潮密度時(shí), 米氏凱倫藻對(duì)鮑魚(yú)抗氧化酶的作用與其他甲藻對(duì)貝類的影響結(jié)果相似。

已有研究表明, 在水體環(huán)境因素(溫度、DO、pH、總氨氮)均適宜的條件下, 高密度米氏凱倫藻可以導(dǎo)致48 h內(nèi)鮑魚(yú)死亡率急劇升高(>50%, 未發(fā)表), 然而, 米氏凱倫藻對(duì)鮑魚(yú)的脅迫方式仍不明確。研究發(fā)現(xiàn), 米氏凱倫藻能夠產(chǎn)生溶血毒素、魚(yú)毒素、活性氧及部分細(xì)胞毒素[16-18], 這些毒性物質(zhì)均為脂溶性物質(zhì), 極易通過(guò)細(xì)胞膜, 進(jìn)入生物體內(nèi)對(duì)其造成影響。其中, 米氏凱倫藻產(chǎn)生的超氧陰離子和過(guò)氧化氫, 能夠通過(guò)氧化細(xì)胞膜的膜脂, 對(duì)生物造成氧化損傷[3]。據(jù)報(bào)道, 許多甲藻對(duì)海洋生物的毒性作用與產(chǎn)生的活性氧有關(guān)。例如, 多環(huán)旋溝藻赤潮導(dǎo)致貝類死亡與藻細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧有關(guān)[19], Tang 等[20]認(rèn)為活性氧是引發(fā)其致死效應(yīng)的主要原因。Yang等[21]認(rèn)為赤潮異彎藻對(duì)虹鱒魚(yú)毒性效應(yīng)也源于其產(chǎn)生的活性氧?；钚匝鯇?duì)生物的影響主要是使酶變性、多聚糖解聚、DNA損傷導(dǎo)致遺傳改變[11], 還可能導(dǎo)致脂類分子過(guò)氧化, 從而使生物膜的完整性受到破壞。本研究中, 在較低赤潮密度下(不超過(guò)107個(gè)/mL), 米氏凱倫藻處理組中, 鮑魚(yú)雖保持較高存活率, 但其SOD、CAT酶活性均受到顯著抑制效應(yīng), 說(shuō)明米氏凱倫藻有可能產(chǎn)生某些活性氧類物質(zhì), 導(dǎo)致短時(shí)間內(nèi)鮑魚(yú)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)遭受嚴(yán)重?fù)p傷, 從而造成對(duì)鮑魚(yú)生命活動(dòng)的脅迫。

致謝: 本實(shí)驗(yàn)得到了中國(guó)科學(xué)院海洋研究所馮頌博士、別煥章和陳燕的大力協(xié)助, 在此致以謝忱。

[1] http: //www.chinanews.com/tp/2012/06-01/3931435.shtml

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(本文編輯: 梁德海)

Effects ofblooms on antioxidant enzymes in gastropod abalone,

LIN Jia-ning1, 2, YAN Tian1, ZHANG Qing-chun1, WANG Yun-feng1, LIU Qing1, ZHOU Ming-jiang1

(1. Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Shandong, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory of Riverine Ecological Conservation and Technology, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China)

To analyze the main threat ofon the physiological features of abalones, we investigated the effects ofon antioxidant enzymes of the abalone, including superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH-Px). The results showed that exposure to a low cell concentration of(not exceeding 104cell/mL) caused significantly adverse effects on the activity of SOD and CAT enzymes in the abalone gills, whereas no adverse effects were observed for the activity of GSH-Px. SOD activity showed an “induced and then inhibited” trend. Compared to the control group,increased SOD activities by 120%, 130%, and 130% during the first 24 h, respectively. Thereafter,caused significant declines in SOD activity of 77%, 77%, and 73% at 48 h. Moreover, compared to the control group, CAT activity was inhibited and declined continuously over 48 h, decreasing by 58%, 51%, and 37%. These results indicate that(not exceeding 104cell/mL) can cause inhibitory effects on the activities of antioxidant enzymes (SOD and CAT).We speculate that the occurrence of abloom could cause oxidative damage to abalone organs during short-term exposure.

Dec. 2, 2015

;; gill; antioxidant enzymes

X55

A

1000-3096(2016)06-0017-06

10.11759/hykx20150330001

2015-12-02;

2016-03-22

(41476102); 中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略重點(diǎn)研究項(xiàng)目(XDA01020304)

[Foundation: National Natural Science Foundation of China, No.41476102; Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, No. XDA01020304]

林佳寧(1988-), 女, 山東煙臺(tái)人, 博士, 主要研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)學(xué), E-mail: ljning0402@163.com; 顏天, 通信作者, 女, 研究員, 主要從事赤潮危害機(jī)制研究, E-mail: tianyan @qdio.ac.cn