江　超，陳映霞，秦叔逵，楊愛珍，馬興群，成　遠(yuǎn)，曹夢(mèng)苒，聞　妹

雷公藤多苷干預(yù)舒尼替尼引起的小鼠腎足細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的機(jī)制研究

江超1，陳映霞1，秦叔逵1，楊愛珍2，馬興群1，成遠(yuǎn)1，曹夢(mèng)苒1，聞妹1

目的 觀察舒尼替尼對(duì)體外培養(yǎng)小鼠腎足細(xì)胞的影響，并探討雷公藤多苷（TWP）對(duì)舒尼替尼所致小鼠腎足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)小鼠腎足細(xì)胞，不同分組給藥處理后，采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot法檢測(cè)小鼠腎足細(xì)胞的增殖抑制率、凋亡率及相關(guān)蛋白（Nephrin、CD2AP）的表達(dá)情況。結(jié)果 小鼠腎足細(xì)胞增殖抑制率隨著舒尼替尼濃度及作用時(shí)間的增加而增加（P＜0.01）；48 h凋亡率隨舒尼替尼濃度增加而增加（P＜0.01）。TWP可降低48 h舒尼替尼引起的小鼠腎足細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率（P＜0.05），同時(shí)可抑制舒尼替尼引起的Nephrin、CD2AP表達(dá)量降低（P＜0.05）。結(jié)論 舒尼替尼可損傷小鼠腎足細(xì)胞；而TWP通過上調(diào)Nephrin、CD2AP蛋白表達(dá)減輕舒尼替尼導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷。

舒尼替尼；抗血管生成；雷公藤多苷；小鼠腎足細(xì)胞；蛋白尿

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-5-9 15：43：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160509.1543.018.html

舒尼替尼是一種口服的小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，能抑制多個(gè)在腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖中起到了關(guān)鍵作用的酪氨酸激酶［1］，因此具有抗血管生成和抗腫瘤作用。然而，研究［2］顯示服用道舒尼替尼的患者蛋白尿的發(fā)生率為21%～63%，在晚期腎癌患者中發(fā)生嚴(yán)重蛋白尿的比例達(dá)6.5%。雷公藤多苷（Tripteryium wilfordii polyglycosidium，TWP）是從雷公藤植物根中提取的總苷，包括雷公藤甲素、雷公藤乙素、雷公藤紅素等，具有抗炎、免疫抑制等作用［3］。臨床上TWP可用于治療多種原發(fā)性及繼發(fā)性腎小球疾病。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［4］顯示TWP通過改善腎小球裂孔膜（slit diaphragm，SD）相關(guān)蛋白的表達(dá)，保護(hù)足細(xì)胞，減少蛋白尿。該研究通過觀察舒尼替尼對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠腎足細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，探索抗血管生成藥物引起蛋白尿形成的可能機(jī)制；并探討TWP是否具有保護(hù)舒尼替尼導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的作用。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑 小鼠腎足細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞中心。主要試劑：舒尼替尼購自美國(guó)輝瑞公司；雷公藤多苷購自浙江得恩德制藥有限公司；DMEM（高糖）培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、0.25%胰酶（含EDTA）購自美國(guó)Thermo公司；重組小鼠γ-干擾素（interferon，IFN-γ）購自美國(guó)PEPROTECH公司；MTT購自美國(guó)Sigma公司；Annexin-V APC/7-AAD雙染凋亡試劑盒、RIPA裂解液（含1 mmol/L PMSF）購自南京凱基生物科技公司；兔抗小鼠Nephrin一抗、兔抗小鼠CD2AP一抗購自美國(guó)Abcam公司；羊抗兔IgG-HRP、GAPDH一抗購自南京凱基生物科技公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠腎足細(xì)胞復(fù)蘇，未分化細(xì)胞用含10%胎牛血清（FPS）、10 U/ml重組小鼠IFN-γ、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素DMEM（高糖）培養(yǎng)基在33℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代后將細(xì)胞在37℃、不含重組小鼠IFN-γ的其他條件相同的環(huán)境下誘導(dǎo)分化2周，待細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)待用。

1.2.2MTT比色法檢測(cè) 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期小鼠腎足細(xì)胞，0.25%胰酶（含EDTA）消化，用含血清的培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。將細(xì)胞以4×104個(gè)/ml接種于96孔板內(nèi)，每孔100 μl，24 h后棄掉上清液，分別加入含藥且無血清培養(yǎng)基，根據(jù)藥物濃度分組為：空白對(duì)照組、舒尼替尼（1、2、3、4、5 μmol/ L）組、TWP 40 ng/ml組及TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組，每組設(shè)4個(gè)平行孔。TWP濃度根據(jù)參考文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，舒尼替尼3 μmol/L接近于該藥作用于足細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加200 μl DMSO，避光振蕩10 min，用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定在570 nm下各孔的吸光度（absorbance，A）值，并計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率。采用藥物相互作用指數(shù)（coefficient of drug interaction，CDI）反映舒尼替尼和雷公藤多苷兩藥相互作用性質(zhì)。CDI值計(jì)算如下：CDI=AB/（A× B）；AB為兩藥聯(lián)用組與空白對(duì)照組A值的比值，A或B是各藥物單獨(dú)使用組與空白對(duì)照組A值的比值。如CDI＜0.9，表示兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同；CDI 0.9～1.1，表示兩藥性質(zhì)為相加；CDI＞1.1，表示兩藥作用性質(zhì)為拮抗（本文中A藥代表舒尼替尼，B藥代表雷公藤多苷）。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期小鼠腎足細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)（同前），后以1×106個(gè)每孔接種于6孔板中，24 h后棄上清液，分別加入含藥的無血清培養(yǎng)基，分組為空白對(duì)照組、不同濃度舒尼替尼（1、3 μmol/L）組、TWP 40 ng/ml組、TWP（40 ng/ ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清液，PBS洗3次，收集非貼壁細(xì)胞。用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集貼壁細(xì)胞，將每孔的非貼壁細(xì)胞和貼壁細(xì)胞混合，2 000 r/min離心5 min后用PBS洗滌重懸細(xì)胞再次離心，共洗滌2次。收集5×105個(gè)細(xì)胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-APC混勻后，加入5 μl 7-AAD，混勻，室溫、避光、反應(yīng)10 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.4Western blot法檢測(cè) 將生長(zhǎng)良好對(duì)數(shù)期小鼠足細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)（同流式細(xì)胞術(shù)）。細(xì)胞分組為空白對(duì)照組、舒尼替尼3 μmol/L組、TWP 40 ng/ml組、TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組，加藥后培養(yǎng)48 h。收集每孔內(nèi)所有細(xì)胞（包括上清液中及貼壁細(xì)胞），用預(yù)冷PBS洗滌后離心（2 000 r/min、5 min）2次，每孔加入含1 mmol/L PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液150 μl裂解提取細(xì)胞總蛋白，4℃、12 000 r/min離心5 min后取上清液；用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)每孔蛋白濃度；取等量40 μg總蛋白質(zhì)經(jīng)8%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉2 h，分別用兔抗小鼠Nephrin、兔抗小鼠CD2AP一抗（按照1∶400稀釋），GAPDH一抗（按照1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，再用按照1∶200稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；ECL試劑發(fā)光、顯影。使用Tanon MP-FLI Capturer軟件成像，Tanon Gel Image System軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。結(jié)果以目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)±s表示。不同藥物分組之間增殖抑制率、凋亡率及相關(guān)蛋白表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1不同組小鼠腎足細(xì)胞的增殖抑制率 不同濃度舒尼替尼作用24、48、72 h后，小鼠腎足細(xì)胞增殖抑制率隨著藥物濃度及作用時(shí)間的增加而增高（F =133.824，P＜0.01），呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性；TWP具有微弱細(xì)胞增殖抑制作用，但隨時(shí)間增加差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組與相同濃度舒尼替尼單藥組比較，48 h抑制率降低（F=45.209，P＜0.01），而24、72 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。48 h組CDI＞1.1，說明在48 h組舒尼替尼與TWP作用性質(zhì)為拮抗，見表1。

2.2不同組小鼠腎足細(xì)胞調(diào)亡率 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同分組給藥48 h后，舒尼替尼1、3 μmol/L組凋亡率分別為（8.98±0.135）%、（47.04±2.180）%，高于空白對(duì)照組（5.92±0.125）%；且舒尼替尼3 μmol/L組高于舒尼替尼1 μmol/L組（P＜0.01）。TWP 40 ng/ml組凋亡率為（4.46±0.32）%，與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組凋亡率低于同等劑量舒尼替尼組（P＜0.01），見圖1。

表1　不同藥物分組小鼠腎足細(xì)胞的增殖抑制率（%，n=4，±s）

表1　不同藥物分組小鼠腎足細(xì)胞的增殖抑制率（%，n=4，±s）

與24 h比較：*P＜0.01；與48 h比較：#P＜0.01；與相同時(shí)間舒尼替尼1 μmol/L組比較：ΔP＜0.01；與相同時(shí)間舒尼替尼2 μmol/L組比較：▽P＜0.05；與相同時(shí)間舒尼替尼3 μmol/L組比較：▲P＜0.05；與相同時(shí)間舒尼替尼4 μmol/L組比較：▼P＜0.05

組別抑制率24 h48 h72 h舒尼替尼1 μmol/L3.67±1.4517.65±7.47*42.09±3.23*#58.18±1.56舒尼替尼2 μmol/L12.04±2.44Δ35.73±1.87*Δ54.14±1.87*#Δ舒尼替尼3 μmol/L23.62±3.64▽46.05±3.92*▽61.06±1.29*#▽舒尼替尼4 μmol/L34.17±5.86▲52.23±3.56*▲69.69±1.91*#▲舒尼替尼5 μmol/L41.40±2.93▼61.02±3.70*▼73.92±2.38*#▼TWP 40 ng/ml8.37±2.372.09±8.641.44±4.18 TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）16.74±5.5126.51±3.83▲

2.3不同分組給藥對(duì)小鼠腎足細(xì)胞蛋白Nephrin、CD2AP表達(dá)水平的影響 給藥48 h后，舒尼替尼（3 μmol/L）組小鼠腎足細(xì)胞蛋白Nephrin、CD2AP表達(dá)較對(duì)空白對(duì)照組降低（FNephrin=47.035、FCD2AP=20.856，P＜0.01）；TWP 40 ng/ml組Nephrin、CD2AP蛋白與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組較舒尼替尼3 μmol/L組增高（FNephrin=16.910、FCD2AP= 12.493，P＜0.05）。見圖2、表2。

圖1　不同分組給藥48 h后小鼠腎足細(xì)胞凋亡情況A：空白對(duì)照組；B：舒尼替尼1 μmol/L組；C：舒尼替尼3 μmol/L組；D：TWP 40 ng/ml組；E：TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組

3　討論

蛋白尿是抗血管生成藥物常見毒副作用，多為無癥狀性［2］，腎活檢病理無顯著改變。少部分患者在服藥期間會(huì)出現(xiàn)大量蛋白尿，并伴有不可逆性腎功能損傷［5］。在服用舒尼替尼期間，當(dāng)24 h尿蛋白大于3.0 g時(shí)需要中斷治療，直至低于該標(biāo)準(zhǔn)后，方可繼續(xù)治療，而達(dá)到腎性蛋白尿時(shí)，則推薦永久性停藥［6］，這將導(dǎo)致有效治療中斷?？寡苌伤幬锼碌鞍啄虻陌l(fā)生可能涉及多個(gè)機(jī)制［7］，包括干擾足細(xì)胞源性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信號(hào)通路、下調(diào)足細(xì)胞連接蛋白、改變腎小球血流動(dòng)力學(xué)、引起亞急性腎小球血栓性微血管病變等。如伴糖尿病等基礎(chǔ)疾病或合并使用腎毒性藥物蛋白尿發(fā)生率較高。

圖2　不同分組給藥48 h后各組Nephrin、CD2AP蛋白的表達(dá)情況A：空白對(duì)照組；B：舒尼替尼3 μmol/L組；D：TWP 40 ng/ml組；E：TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組

表2　不同分組給藥48 h后，各組Nephrin、CD2AP蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）

表2　不同分組給藥48 h后，各組Nephrin、CD2AP蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s）

與空白對(duì)照組比較：*P＜0.01；與TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）組比較：#P＜0.05

組別CD2AP/GAPDHNephrin/GAPDH空白對(duì)照0.820±0.0360.796±0.045舒尼替尼3 μmol/L0.577±0.085*#0.530±0.050*#TWP 40 ng/ml0.866±0.0760.788±0.079 TWP（40 ng/ml）+舒尼替尼（3 μmol/L）0.783±0.0550.683±0.041

足細(xì)胞和足突相互交錯(cuò)構(gòu)成的SD作為腎小球?yàn)V過膜的關(guān)鍵部分，參與了腎小球?yàn)V過膜機(jī)械和電荷屏障的建立。足細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，再生能力有限［8］，一旦受損必將導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜的破壞，血液中大分子蛋白濾過，形成蛋白尿。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，舒尼替尼在體外可抑制小鼠腎足細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)劑量依賴性和時(shí)間依賴性；且舒尼替尼能誘導(dǎo)小鼠腎足細(xì)胞凋亡。提示抗血管生成劑相關(guān)蛋白尿發(fā)生的機(jī)制與小鼠腎足細(xì)胞受損相關(guān)。

Nephrin是第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的由足細(xì)胞產(chǎn)生特異性表達(dá)于SD上的跨膜蛋白，是引起先天性腎病綜合癥（芬蘭型）的致病基因的產(chǎn)物［9］，是一種信號(hào)受體分子，其胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸磷酸化而起到信號(hào)傳導(dǎo)作用。同時(shí)還維持著SD的完整性和足細(xì)胞的正常形態(tài)及功能。CD2AP在腎臟主要由足細(xì)胞產(chǎn)生，是一種胞質(zhì)蛋白，具有信號(hào)傳導(dǎo)和介導(dǎo)蛋白相互作用的功能。CD2AP在足細(xì)胞中與其他的SD分子Nephrin、Podocin形成復(fù)合體，維持足細(xì)胞裂孔膜的結(jié)構(gòu)和正常功能［10］。因此Nephrin、CD2AP在維持足細(xì)胞生理功能、腎小球?yàn)V過屏障的完整和蛋白尿的產(chǎn)生中起到重要作用。研究［11］顯示，拮抗VEGF或VEGFR均可導(dǎo)致腎小管內(nèi)皮細(xì)胞增生、肥大，細(xì)胞連接松散，其原因與足細(xì)胞上Nephrin蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，舒尼替尼可降低小鼠腎足細(xì)胞SD關(guān)鍵蛋白Nephrin、CD2AP的表達(dá)，這將導(dǎo)致腎小球SD結(jié)構(gòu)和功能的完整性被破壞。這可能是舒尼替尼等抗血管生成藥物導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生的重要機(jī)制。

研究［4，12］顯示，TWP對(duì)一些大鼠腎病模型中足細(xì)胞具有保護(hù)作用，并可上調(diào)Nephrin、Podocin、CD2AP等足細(xì)胞SD蛋白的表達(dá)，從而改善足細(xì)胞病變減少尿蛋白。本研究顯示，TWP對(duì)舒尼替尼導(dǎo)致的小鼠足細(xì)胞的增殖抑制及細(xì)胞凋亡有改善作用。采用TWP干預(yù)時(shí)，可上調(diào)SD關(guān)鍵蛋白Nephrin、CD2AP的表達(dá)。提示TWP可能對(duì)抗血管生成劑所致蛋白尿具有一定的預(yù)防和治療價(jià)值。

研究［13］顯示，雷公藤中二萜類化合物具有廣譜抗癌活性，且其中的有效成分如雷公藤內(nèi)酯醇可通過抑制Toll樣受體4和核因子-κB（TLR4/NF-κB）信號(hào)通路、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究［14］顯示，TWP中有效成分雷公藤紅素可抑制腫瘤血管生成。因此TWP與舒尼替尼等抗血管生成藥物聯(lián)合使用，除了可改善其導(dǎo)致的腎足細(xì)胞的損傷外，是否具有一定的協(xié)同抗腫瘤、抗血管形成效應(yīng)，值得進(jìn)一步研究。雷公藤制劑早先被認(rèn)為是一種免疫抑制劑，近年研究［15］顯示其具有雙相免疫調(diào)節(jié)作用，另外還具有肝腎、生殖系統(tǒng)等毒性。在與抗腫瘤藥物、抗血管形成藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其如何影響免疫功能，其他毒性是否會(huì)疊加，均需要進(jìn)行深入細(xì)致的研究。

綜上所述，舒尼替尼在體外可損傷小鼠腎足細(xì)胞，下調(diào)其SD關(guān)鍵蛋白Nephrin、CD2AP的表達(dá)。TWP通過上調(diào)Nephrin、CD2AP蛋白的表達(dá)同時(shí)改善舒尼替尼導(dǎo)致的足細(xì)胞損傷。下一步將進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本研究結(jié)果，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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Research on the mice podocyte apoptosis and expression of the associated protein caused by TWP intervene sunitinib

Jiang Chao，Chen Yingxia，Qin Shukui，et al
（Dept of Medical Oncology，81st Clinical Medical College of Anhui Medical University，Nanjing 210002）

Objective To observe the effect of sunitinib culturing mice podocyte in vitro，moreover，probe into the protective effect of Tripterbium wilfordii polyglycosidium（TWP）to the cell trauma which caused by sunitinib and its mechanisms.Methods Cultured mice podocyte in vitro，after given medicine to different groups，detected the proliferation inhibiting rate，apoptosis rate and the expression status of the mice podocyte related protein（Nephrin，CD2AP）by MTT，F(xiàn)CM and Western blot methods.Results The proliferation inhibition rate of the mice podocyte was increased with the increasing of sunitinib dose and treated time（P＜0.01）.The apoptosis rate of mice podocyte increased with the increasing of the dose of sunitinib at 48 h（P＜0.01）.TWP could decrease the proliferation inhibition and apoptosis of the mice podocyte which caused by sunitinib at 48 h（P＜0.05），at the same time it could inhibit the decrease of the mice podocyte related protein（Nephrin，CD2AP）expression which caused by sunitinib（P＜0.05）.Conclusion Sunitinib can damnify mice podocyte，but TWP can induce the mice podocyte cell trauma caused by sunitinib through up-regulating Nephrin and CD2AP expression.

sunitinib；anti-angiogenesis；Tripterygium wilfordii polyglycosidium；mice podocyte；proteinuria

R 73-34

A

1000-1492（2016）06-0800-05

2016-03-04接收

南京軍區(qū)重點(diǎn)課題基金項(xiàng)目（編號(hào)：14ZD21）

安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍八一臨床學(xué)院1腫瘤內(nèi)科、2中心實(shí)驗(yàn)室，南京 210002

江 超，男，碩士研究生；陳映霞，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenyingxiacsco@163.com