李家泉 鄭昆芳
摘要:目的建立熊膽汁中?;切苋パ跄懰岷康腍PLC測定方法。方法用甲醇前處理熊膽汁;以十八烷基鍵合硅膠為填料;甲醇-磷酸二氫鈉溶液(0.03 mol/L)(68:32)為流動相,并用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.4;柱溫40℃;流速1.0 mL/min;進(jìn)檢測波長為210 nm。結(jié)果牛磺熊去氧膽酸進(jìn)樣濃度在0.1045 mg/mL~1.045 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系,r=0.9999,回收率在98%~102%之間,回收率RSD<1.5%。結(jié)論方法準(zhǔn)確、簡便、快速,可為熊膽汁的檢測及監(jiān)控提供技術(shù)依據(jù)和支持。
關(guān)鍵詞:熊膽汁;HPLC法;牛磺熊去氧膽酸;含量測定
中圖分類號:284文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號:1007-2349(2016)10-0078-03
Study on Taurocholate Ursodeoxycholic Acid Content in Bear Bile by HPLC
LI Jia-quan, ZHENG Kun-fang
(Dali Ruipin Junge Pharmaceutical Co., Ltd., Dali 671099, Yunnan)
【Abstract】Objective: To establish a HPLC method to determine taurocholate ursodeoxycholic acid content in bear bile. Methods: Bear bile was pre-treated with methanol. Octadecyl bonded silica was taken as a filler, methanol-sodium dihydrogen phosphate solution (0.03 mol/L) (68:32) as mobile phase, and phosphoric acid was used to adjust to pH 4.4. The column temperature was 40℃, with 1.0 mL/min of flow rate, 210 nm of detection wavelength. Results: The sample concentration of taurocholate ursodeoxycholic acid showed a good linear relationship between 0.1045 mg/mL and 1.045 mg/mL, r=0.9999, with the recovery rate between 98% to 102% and recovery rate RSD <1.5%. Conclusion: The method is accurate, simple and rapid, and can provide a technical base and support for the detection and monitoring of bear bile.
【Key words】bear bile, HPLC method, taurocholate ursodeoxycholic acid, determination
熊科動物黑熊經(jīng)膽囊手術(shù)引流而得熊膽汁經(jīng)干燥制成的熊膽粉,已收載于1989年試行、1996年轉(zhuǎn)為國家正式實(shí)行的藥品標(biāo)準(zhǔn)[1],并收載于2015年版《中國藥典》附錄,作為天然熊膽的替代品入藥。?;切苋パ跄懰幔═CDCA)是熊膽粉主要有效和特有成分,故熊膽粉藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定TUDCA的含量不得低于23%。但熊膽粉藥品標(biāo)準(zhǔn)中未對其原料熊膽汁中TUDCA含量的測定方法作出規(guī)定。而熊膽汁和熊膽粉中TUDCA含量的測定方法有一定的差異。熊膽汁原料關(guān)乎到所制成熊膽粉的質(zhì)量,對熊膽汁質(zhì)量的分析和控制是十分重要的,而其TUDCA含量的測定方法沒有報道。本文建立熊膽汁中?;切苋パ跄懰岷康腍PLC測定方法。方法準(zhǔn)確、簡便、快速,為熊膽汁的檢測及監(jiān)控提供技術(shù)依據(jù)和支持。
1儀器與試藥
LC98Ⅰ型、LC99Ⅱ型高效液相色譜儀(北京溫分分析技術(shù)有限公司)、7725Ⅰ型手動進(jìn)樣閥、雙通道色譜軟件工作站(浙大智達(dá))、UV98I可變波長紫外檢測器、C18 5μShodex ID4.6×250mm色譜柱(原裝進(jìn)口)、BCD-176SQMK型美的電冰箱(合肥美的電冰箱有限公司)、SK3300H型超聲儀(上??茖?dǎo)超聲儀器有限公司)、微孔濾膜(上海津騰)、色譜甲醇(fisher)、牛磺熊去氧膽酸鈉(中國食品藥品檢定研究院,110816-201208,含量91.7%,?;切苋パ跄懰釗Q算因子為0.9578)、分析純磷酸二氫鈉(國藥)、分析純甲醇(國藥)、熊膽汁(云南大理瑞品金閣藥業(yè)有限公司)。
2方法與結(jié)果
2.1色譜條件 以十八烷基鍵合硅膠為填料;甲醇-磷酸二氫鈉溶液(0.03 mol/L)(68:32)為流動相,并用磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.4,柱溫40℃,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量5 μL,檢測波長為210 nm。理論板數(shù)按牛磺熊去氧膽酸峰計算不低于2500。在上述條件下,TUDCA與樣品中其它成分均能完全分離,分離度大于1.5。對照品與樣品圖譜見圖1A、B。
圖1對照品(A)和樣品(B)色譜圖
2.2樣品制備 取新鮮熊膽汁,過120目標(biāo)準(zhǔn)篩,精密量取續(xù)濾液0.5 mL置50 mL量瓶中。第一份加甲醇稀釋至刻度,搖勻;第二份加乙醇,稀釋至刻度,搖勻。取上述溶液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜法過濾后,進(jìn)樣5μL測定,圖譜見圖2—A、B。
圖2乙醇為稀釋劑對照品(A)和甲醇為稀釋劑對照品(B)色譜圖
通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,利用乙醇作為稀釋劑存在拖尾,n<2000;而甲醇作為稀釋劑,峰型尖銳,無拖尾及前沿現(xiàn)象,n>4500,故選擇甲醇作為稀釋劑。
2.3對照品溶液制備取?;切苋パ跄懰徕c對照品適量,精密稱定,加甲醇使溶解并定量稀釋制成每1 mL含1 mg的溶液,即得。
2.4供試品制備取熊膽汁不少于25 mL,過120目標(biāo)準(zhǔn)篩,精密量取續(xù)濾液1 mL置100 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.5線性關(guān)系考察精密稱取?;切苋パ跄懰徕c對照品28.5 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻。再分別精密吸取上述對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0 mL置5 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻得系列濃度對照品溶液。取系列濃度對照品溶液各5 μL,注入液相色譜儀,按上述方法測定。以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),得回歸方程為:
A=281822.207.C-1614.773r=0.9999
結(jié)果表明:TUDCA進(jìn)樣濃度在0.1045 mg/mL~1.045 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。
2.6準(zhǔn)確度考察取新鮮熊膽汁,照供試品制備方法制備并測定樣品中牛磺熊去氧膽酸的含量,作為已知濃度的供試品。精密量取已知濃度的供試品溶液0.5 mL置50 mL量瓶中,分別制作3組,每組3份,第1組每份精密加入對照品溶液(精密稱取牛磺熊去氧膽酸鈉對照品284.6 mg,置250 mL量瓶中,加甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻。)10.00 mL;第2組每份精密加對照品溶液15.00 mL;第3組每份精密加入對照品溶液20.00 mL,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,過濾,取5 μL注入液相色譜儀測定,測得供試品中TUDCA的含量為45.22 mg/mL。回收率結(jié)果見下表。
2.7.1重復(fù)性取新鮮熊膽汁照供試品制備方法制備6份,進(jìn)樣檢測,測定結(jié)果TUDCA的含量分別為45.88、46.01、45.82、45.20、45.94、45.92 mg/mL。平均值為45.8 mg/mL,測定值的RSD為0.59%。結(jié)果表明,該方法重復(fù)性良好。
2.7.2中間精密度取同一均質(zhì)熊膽汁,由兩個分析員分別測定,每人測定6份,TUDCA的含量結(jié)果如下。
2.8專屬性考察按照供試品制備方法對空白溶液(甲醇)進(jìn)行處理作為空白組,照上述方法分別測定對照品組、熊膽汁供試品組與空白溶液組,檢測結(jié)果顯示,在該方法下,在供試品主峰保留時間±1.0 min內(nèi)無干擾峰。結(jié)果表明,該方法專屬性良好。圖譜見圖3—A、B、C。
2.9耐用性實(shí)驗(yàn)
2.9.1流動相比例變化±5%照供試品制備方法制備供試品,流動相比例按甲醇:磷酸二氫鈉溶液(0.03mol/L)比例變化為:63:37、68:32、73:27分別進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示在不同比例下,主峰保留時間分別為13.9~14.0、8.2~8.3、5.9~6.0 min之間。n均大于4000,R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結(jié)果分別為43.4、43.0、43.6 mg/mL,三者RSD為0.69%。結(jié)果表明,該方法流動相比例耐用性良好。
2.9.2流動相pH值變化±0.2照供試品制備方法制備供試品,流動相用磷酸調(diào)節(jié)PH值分別為4.2、4.4、4.6進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果顯示在不同PH值下,主峰保留時間分別為9.2~9.3、9.5~9.7、9.3~9.5 min之間。n均大于4000,R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結(jié)果分別為39.3、39.1、40.0 mg/mL,三者RSD為1.20%。結(jié)果表明,該方法流動相PH值耐用性良好。
2.9.3柱溫變化±5℃照供試品制備方法制備供試品,在柱溫35℃、40℃、45℃下分別測定。檢測結(jié)果顯示在不同柱溫下,主峰保留時間分別為10.2~10.3、9.7~9.9、8.4~8.6 min之間。n均大于4000,R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結(jié)果分別為45.4、45.6、46.1 mg/mL,三者RSD為0.79%。結(jié)果表明,該方法柱溫耐用性良好。
2.9.4流速相對值變化±20%照供試品制備方法制備供試品,,在流速為0.8 mL/min、1.0 mL/min 與1.2 mL/min下分別測定。檢測結(jié)果顯示在不同流速下,主峰保留時間分別為11.2~11.4、9.9~10.1、7.8~7.9 min之間。n均大于4000,R均大于1.5。同一供試品TUDCA的含量測定結(jié)果分別為44.4、45.0、43.8 mg/mL,三者RSD為1.35%。結(jié)果表明,該方法流速耐用性良好。
2.10樣品檢測根據(jù)上述方法,對連續(xù)10天內(nèi)產(chǎn)出的10批次熊膽汁TUDCA的含量進(jìn)行了檢測,其結(jié)果如下。
3討論
3.1樣品處理方式的選擇本項(xiàng)研究中,熊膽汁樣品分別用甲醇和乙醇進(jìn)行處理。經(jīng)對比實(shí)驗(yàn),得到用甲醇處理優(yōu)于乙醇處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。熊膽汁樣品處理沒有明確的方法,有的文獻(xiàn)認(rèn)為需用某些蛋白沉淀劑處理。本項(xiàng)研究用甲醇處理并獲得較好的結(jié)果,操作方便快速,簡化了樣品前處理過程,降低了檢測成本,又提高了檢測效率。
3.2流動相組分比例的選擇流動相采用甲醇-磷酸二氫鈉溶液(0.03 mol/L)的比例為68:32,試驗(yàn)結(jié)果TUDCA與樣品中其它成分均能完全分離,分離度大于1.5,主峰保留時間適中,表明流動相的這一組分比例可用于熊膽汁樣品中TUDCA的含量測定。這一組分比例與熊膽粉檢測流動相組分的比例是有一定差異的,比例差異的原因可能與熊膽汁未經(jīng)過熱處理而熊膽粉受過熱烘干有關(guān)。
參考文獻(xiàn):
[1]衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn),熊膽粉,第十一冊,1996,WS3-09(B-09)-96(Z).