張文靜,劉云飛,陳舜勝

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

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由蝦殼制備的蛋白水解物-檸檬酸鈣的復(fù)合鈣粉的生物利用率研究

張文靜,劉云飛,陳舜勝*

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306)

目的:評(píng)價(jià)從蝦殼中制取的蛋白水解物-檸檬酸鈣復(fù)合鈣粉(PHC-Ca)的生物利用率。方法:選擇4周齡體重?zé)o顯著性差異的SD大鼠60只,隨機(jī)分為6組,在自由進(jìn)食低鈣飼料的基礎(chǔ)上分別以PHC-Ca、碳酸鈣(CaCO3)、檸檬酸鈣、葡萄糖酸鈣以及蝦殼細(xì)粉灌胃飼養(yǎng),每日灌胃劑量為66.5 mg Ca/(kg·d)(以鈣劑量及大鼠體重為計(jì)算指標(biāo))。喂養(yǎng)至4周末進(jìn)行3 d代謝實(shí)驗(yàn),測(cè)定鈣表觀吸收率、儲(chǔ)存率。繼續(xù)喂養(yǎng)至8周末,觀察大鼠體格增長并測(cè)定血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平以及股骨相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果:低鈣對(duì)照組大鼠各項(xiàng)體生長指標(biāo)均顯著低于除碳酸鈣組外的其他組(p<0.05);PHC-Ca能顯著提高大鼠鈣表觀吸收率、鈣儲(chǔ)存率,且能降低血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平(p<0.05);攝食PHC-Ca、葡萄糖酸鈣的大鼠,其血清鈣水平無顯著性差異(p>0.05)且高于其他組;PHC-Ca組大鼠股骨鈣、股骨長、股骨干重指標(biāo)高于葡萄糖酸鈣組、檸檬酸鈣組、蝦殼粉組(p<0.05)。結(jié)論:從蝦殼中制取的PHC-Ca有促進(jìn)鈣吸收的效果,其生物利用率優(yōu)于相同鈣含量的檸檬酸鈣以及蝦殼粉,可作為一種良好的膳食鈣補(bǔ)充劑。

蝦殼,蛋白水解物-檸檬酸鈣,生物利用率

鈣是組成人體骨骼、牙齒支架的主要元素。鈣離子參與人體生命活動(dòng),是傳遞細(xì)胞間主要信息的使者,其生理代謝對(duì)人體極為重要。攝入過量鈣易沉積加重腎臟的負(fù)擔(dān),缺乏鈣會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等癥狀。因此,鈣的吸收利用情況引起越來越多關(guān)注,在尋求來源豐富的天然鈣基礎(chǔ)上,研究出一種生物利用率高的補(bǔ)鈣產(chǎn)品極為迫切。

鈣吸收的過程為胃中消化、小腸吸收、血液運(yùn)輸、骨骼沉積,從而促進(jìn)大鼠骨骼生長。在胃液作用下消化為Ca2+,一部分被代謝出體外一部分被小腸吸收,被吸收的Ca2+在氨基酸的作用下進(jìn)入血液。而后在血液的運(yùn)輸下進(jìn)入骨骼,最終沉積于骨質(zhì)[1]。因此,本實(shí)驗(yàn)考察大鼠的代謝指標(biāo),血清中堿性磷酸酶、骨鈣素等鈣入骨指標(biāo)[2],骨骼指標(biāo)等。除此之外,鈣吸收效果最明顯是體格指標(biāo)。

表1　大鼠分組及喂食鈣劑量

注:*以鈣的劑量及大鼠體重為計(jì)算指標(biāo)。

蛋白水解成小分子的氨基酸、多肽,有促進(jìn)鈣吸收的效果。來源不同的蛋白水解成了不同的多肽、氨基酸,其中蛋清肽、鱈魚皮膠原蛋白肽、魚卵肽能有效地促鈣吸收[3-6]。蝦殼中含有豐富的蛋白,酶處理將其分解為小分子多肽氨基酸與鈣質(zhì)、甲殼素分離從而達(dá)到高值利用。然而利用其蛋白水解物探討促鈣吸收的研究鮮有報(bào)道。葡萄糖酸鈣、乳酸鈣、檸檬酸鈣等有機(jī)鈣被認(rèn)為是良好的鈣源應(yīng)用于食品工業(yè)[7]。其中檸檬酸鈣制備方法成熟,來源廣,存在于天然水果的檸檬酸與蝦殼中豐富的鈣質(zhì)結(jié)合制備檸檬酸鈣,可用于鈣強(qiáng)化食品中[8]。

2015中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒中顯示,2014年全國海水養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)產(chǎn)量總值為87萬噸,占蝦類總產(chǎn)值的75%左右[9]。而蝦殼中富含蛋白質(zhì)、鈣質(zhì)、甲殼素、蝦紅素等,僅作為魚飼料低值利用。為更好地利用天然蝦殼,蝦殼中的蛋白、鈣質(zhì)等有益物質(zhì)成為了研究的熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)以南美白對(duì)蝦蝦殼作為鈣源,制取蛋白水解物-檸檬酸鈣復(fù)合鈣粉,分析比較制備的復(fù)合鈣粉與其他不同類型的鈣制劑生物利用率,分析其利用價(jià)值,為居民選擇合適的補(bǔ)鈣制劑提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

4周齡SD大鼠(Sprague-Dawley)60只,清潔級(jí),上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(滬)2013-0006,飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(22±2)℃、濕度60%±5%;蛋白水解物-檸檬酸鈣復(fù)合鈣粉(PHC-Ca)為實(shí)驗(yàn)室自制,其中鈣含量為19.6%,總氨基酸含量18.3%,脂肪0.44%;胰蛋白酶(1∶250,酶活力≥50000 U/g)、檸檬酸、檸檬酸鈣、碳酸鈣分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖酸鈣口服溶液哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司;血清鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素檢測(cè)試劑盒艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心。

石墨爐消化爐長沙基隆儀器有限公司;MARS6微波消解儀美國CEM公司;Zoonit700原子吸收分光光度儀德國耶拿;BS-200全自動(dòng)生化分析儀邁瑞醫(yī)療國際有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1低鈣飼料的制備為建立低鈣喂養(yǎng)模型,制備低鈣飼料[10],其中鈣含量為0.1%。配方如下:酪蛋白19.4%,大豆油10.0%,玉米淀粉39.3%,麥芽糖糊精13.6%,蔗糖8.7%,纖維素5.0%,維生素混合物1.0%,DL-蛋氨酸0.1%,酒石酸膽堿0.2%,TBHQ 0.002%,礦物質(zhì)混合物2.5%(鈣0.1%)。

1.2.2PHC-Ca的制取參考文獻(xiàn)[11]的方法制備PHC-Ca:洗凈的南美白對(duì)蝦(PenaeusvannameiBoone)蝦殼置于80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干6 h,研磨過篩100目,制得蝦殼細(xì)粉,直徑<0.15 mm。稱取2 g蝦殼細(xì)粉以料液比1∶20加去離子水,均質(zhì)5 min后進(jìn)行酶解。利用胰蛋白酶酶解[11]:加酶量2.5×103U/g,pH8.0,溫度45 ℃,酶解1.5 h,滅酶5 min。冷卻至室溫后,經(jīng)5000 r/min離心10 min收集上層液,分離殘?jiān)?。而后在殘?jiān)欣^續(xù)添加20 mL,0.34 mol/L的檸檬酸,處理1.5 h后收集上層液。將兩次收集的上層液合并、濃縮、80 ℃烘干后即為PHC-Ca。

1.2.3大鼠實(shí)驗(yàn)分組與喂養(yǎng)方式4周齡70～80 g體重大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,挑選體重?zé)o顯著性差異的大鼠60只,分為6組:低鈣對(duì)照組、PHC-Ca組、蝦殼細(xì)粉組、碳酸鈣組、檸檬酸鈣組、葡萄糖酸鈣組,每組10只。各組大鼠自由進(jìn)食低鈣飼料、飲用去離子水,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行每日灌胃飼養(yǎng)8周。灌胃劑量(以鈣的劑量為計(jì)算指標(biāo))參考人體(成年人體質(zhì)量60 kg)每日需攝入鈣含量800 mg,換算為13.3 mg Ca/(kg·d),中劑量66.5 mg Ca/(kg·d)吸收效果較好[12]。鈣制劑與去離子水混合灌胃量為0.5 mL,低鈣對(duì)照組每日灌胃0.5 mL去離子水(表1)。

1.2.4鈣表觀吸收率的測(cè)定大鼠體重需每日稱量,喂養(yǎng)至4周后將大鼠放入代謝籠中收集3 d糞便、尿液至100 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥,恒重后磨成粉,利用火焰原子吸收測(cè)定代謝物中鈣含量。

鈣表觀吸收率(%)=(攝入鈣-糞鈣)/攝入鈣×100

鈣儲(chǔ)存率(%)=(攝入鈣-糞鈣-尿鈣)/攝入鈣×100

1.2.5血清中鈣相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定喂養(yǎng)大鼠至8周后將其解剖,取動(dòng)脈血,4 ℃靜置0.5 h,10000 r/min、4 ℃離心取上層血清,4 ℃保存。利用生化自動(dòng)分析儀測(cè)定血清鈣、磷、堿性磷酸酶、骨鈣素含量。

1.2.6股骨干重、骨長、骨鈣含量的測(cè)定將大鼠處死后取右股骨,用游標(biāo)卡尺測(cè)定長度,烘干恒重后稱股骨干重,最后利用火焰原子吸收法測(cè)定骨鈣含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

所有測(cè)定數(shù)據(jù)均重復(fù)10次,測(cè)定值通過平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,通過SSPS17.0軟件處理,組間比較采用LSD法(least significant difference),p<0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2　結(jié)果與討論

2.1PHC-Ca對(duì)大鼠生長的影響

大鼠體格指標(biāo)是鈣制劑吸收效果評(píng)定的關(guān)鍵指標(biāo)。由表2可知,實(shí)驗(yàn)初期各組大鼠體重、身長無顯著性差異。喂食8周后,各種鈣制劑對(duì)大鼠的生長均有一定促進(jìn)作用。喂養(yǎng)期間,低鈣對(duì)照組大鼠較其他組瘦小,毛色暗淡。低鈣對(duì)照組大鼠體重與碳酸鈣組無顯著性差異(p>0.05),PHC-Ca組、蝦殼粉組大鼠體重最大,與葡萄糖酸鈣組有顯著性差異(p<0.05)。低鈣對(duì)照組大鼠身長顯著低于其他組(p<0.05)。除碳酸鈣組,PHC-Ca組、葡萄糖酸鈣組、檸檬酸鈣組大鼠身長無顯著性差異(p>0.05)。表明足量的鈣質(zhì)是保證大鼠正常生長發(fā)育的前提,PHC-Ca中的蛋白水解物、蝦殼粉中的蛋白是有助體格增長的營養(yǎng)素。

喂食組別體重(g)身長(cm)初始體重第8周初始身長第8周低鈣對(duì)照組93.38±3.78a186.77±3.79d11.32±0.92a19.25±0.69cPHC-Ca組93.84±3.66a219.02±5.83a11.22±0.87a22.16±0.73aCaCO3組92.39±4.47a194.54±6.76dc11.35±0.64a20.03±0.73b檸檬酸鈣組93.08±4.76a200.10±10.97c11.43±0.48a21.56±0.59a葡萄糖酸鈣組92.89±3.68a206.85±5.53b11.37±0.62a21.51±0.45a蝦殼細(xì)粉組93.67±5.03a212.08±2.99a11.28±0.43a21.62±0.61a

注:同一列中上標(biāo)字母相同者無顯著性差異(p>0.05),上標(biāo)字母不同者存在顯著性差異(p<0.05),表3～表5同。

表3　大鼠攝入不同鈣制劑對(duì)其鈣吸收的影響±s,n=10)

2.2PHC-Ca對(duì)大鼠體內(nèi)鈣吸收效果的影響

大鼠攝入鈣制劑,在胃液作用下將其分解為離子態(tài),進(jìn)入小腸中一部分被吸收利用。因此,鈣表觀吸收率,鈣儲(chǔ)存率能反映鈣在大鼠體內(nèi)表觀的情況。由表3可知,大鼠僅攝食低鈣飼料,鈣表觀吸收率、儲(chǔ)存率均顯著高于其他組(p<0.05)。可能是大鼠因缺鈣產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),對(duì)少量的鈣吸收效果顯著增加。PHC-Ca、葡萄糖酸鈣組大鼠鈣表觀吸收率顯著高于檸檬酸鈣、碳酸鈣、蝦殼粉組(p<0.05)。PHC-Ca組大鼠代謝物中糞鈣、尿鈣含量較低,可能是PHC-Ca溶解性好,成分中的小分子蛋白水解物能促進(jìn)鈣的吸收,葡萄糖酸鈣為液體有機(jī)酸鈣,在小腸中被充分吸收,因此,兩者鈣表觀吸收率較高。

2.3PHC-Ca對(duì)大鼠血清鈣水平的影響

鈣離子經(jīng)小腸吸收后進(jìn)入血液,匯集于血清,因此血清中鈣相關(guān)指標(biāo)是評(píng)價(jià)鈣吸收效果的重要方法。由表4可知,PHC-Ca、葡萄糖酸鈣組大鼠血清鈣、磷水平都高于其他組(p<0.05),可能是PHC-Ca、葡萄糖酸鈣中的氨基酸、多肽、葡萄糖是促鈣吸收的物質(zhì),使小腸吸收的鈣基本進(jìn)入血液。血清堿性磷酸酶、骨鈣素水平又是骨代謝標(biāo)志物,能維持鈣在骨骼中的礦化的速率[13],攝食相同鈣含量不同鈣制劑的大鼠,其骨鈣素水平無顯著差異。低鈣對(duì)照組大鼠血清中堿性磷酸酶、骨鈣素骨代謝指標(biāo)顯著高于其他組(p<0.05),表明在缺鈣狀態(tài)下,大鼠骨鈣不斷流失。

2.4PHC-Ca對(duì)大鼠股骨指標(biāo)的影響

鈣離子通過血液的運(yùn)輸最終在骨骼的無機(jī)質(zhì)中沉積成鈣鹽,構(gòu)成骨骼的基本結(jié)構(gòu)。股骨的長勢(shì)是大鼠骨骼生長的主要指標(biāo),從股骨干重、骨長、骨鈣結(jié)果(見表5)中看出攝食PHC-Ca的大鼠骨骼長勢(shì)顯著優(yōu)于其他組(p<0.05)。蝦殼粉作為補(bǔ)鈣產(chǎn)品其鈣吸收效果不及由蝦殼制取的PHC-Ca。PHC-Ca的生物利用率高于檸檬酸鈣,蝦殼中蛋白水解物有效地促鈣吸收。因此,PHC-Ca無需純化,可直接作為膳食鈣補(bǔ)充劑。經(jīng)分析,PHC-Ca與其他鈣制劑相比能更好地促進(jìn)大鼠骨骼的生長,預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。

組別血清鈣(mmoL/L)血清磷(mmoL/L)堿性磷酸酶(IU/L)骨鈣素(ng/mL)低鈣對(duì)照組2.364±0.072d1.568±0.017c219.40±6.52a0.712±0.037aPHC-Ca組2.871±0.089a1.842±0.029a189.40±6.52d0.421±0.011bCaCO3組2.655±0.035c1.679±0.029b196.10±5.51b0.446±0.033b檸檬酸鈣組2.715±0.047b1.665±0.033b193.00±7.59c0.440±0.036b葡萄糖酸鈣組2.898±0.069a1.809±0.051a190.20±3.76d0.456±0.026b蝦殼細(xì)粉組2.725±0.053b1.596±0.059c194.40±6.62c0.492±0.027b

組別股骨干重(g)股骨長(cm)股骨鈣(mg/g)低鈣對(duì)照組0.1938±0.0024d2.72±0.02d152.8±3.2dPHC-Ca組0.2783±0.0074a2.93±0.01a191.4±4.3aCaCO3組0.2388±0.0083c2.83±0.03c177.7±3.1c檸檬酸鈣組0.2645±0.0161b2.85±0.04c183.7±5.2b葡萄糖酸鈣組0.2681±0.0179b2.90±0.03b189.6±2.9b蝦殼細(xì)粉組0.2370±0.0064c2.91±0.03b183.0±3.0b

通過比較5種不同類型的鈣制劑生物利用率相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)利用胰蛋白酶-檸檬酸聯(lián)用的方式制取PHC-Ca,其生物利用率優(yōu)于蝦殼細(xì)粉。蝦殼細(xì)粉中的蛋白能促進(jìn)大鼠體格生長,但從表觀吸收率、血清鈣水平、骨鈣含量等指標(biāo)得到,促鈣吸收的效果較差,綜合評(píng)價(jià)其生物利用率較低。相比之下,大鼠僅攝食低鈣飼料時(shí),因缺鈣引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng),鈣表觀吸收率較高,但其血清鈣、骨鈣處于各組最低水平,未達(dá)到補(bǔ)鈣效果。

PHC-Ca與葡萄糖酸鈣吸收效果較好,可能是兩者在胃中溶解性好,得以充分吸收[14]。與檸檬酸鈣相比其生物利用率較高,可能是PHC-Ca中的小分子多肽、氨基酸是促生長、促鈣吸收的營養(yǎng)物質(zhì),這與氨基酸、魚骨粉酶解物促鈣吸收的研究結(jié)論一致[15-17]。PHC-Ca是利用廢棄的蝦殼制取而成,其成分中的蛋白水解物是促鈣吸收的關(guān)鍵因素。因此,無需進(jìn)一步純化PHC-Ca。

3　結(jié)論

PHC-Ca組大鼠體格、血清鈣磷水平、骨鈣含量等指標(biāo)最高,表明PHC-Ca能有效地促進(jìn)鈣的吸收,其生物利用率優(yōu)于相同鈣含量的檸檬酸鈣以及蝦殼粉。綜上所述,PHC-Ca可作為一種良好的膳食鈣補(bǔ)充劑添加到食品中。蝦殼中的蛋白與鈣質(zhì)可作為天然的蛋白鈣源進(jìn)一步回收利用,為蝦類廢棄物的綜合利用作參考。

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Study on bioavailability of protein hydrolysate-citrate calcium prepared from shrimp shell

ZHANG Wen-jing,LIU Yun-fei,CHEN Shun-sheng*

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Objective:To evaluate bioavailability of protein hydrolysate-citrate calcium(PHC-Ca)from shrimp shell. Method:4 weeks SD rats were randomly divided into 6 groups with 10 rats in each,and then gavaged with PHC-Ca,CaCO3,calcium citrate,calcium gluconate,shrimp shell powder based on low calcium diet and low calcium control diet for 8 weeks. The calcium gavage dose to rats was 66.5 mg Ca/(kg·d). Calcium metabolic test was conducted by the end of the forth week. Moreover,the index related to serum and bone were assayed by the end of the 8th week. Result:The rats’ growth index in low calcium was lower than other group except CaCO3.The calcium absorption rate of PHC-Ca group was remarkable high than other groups except low calcium control. Furthermore,the level of ALP,BGP,in serum indicated that PHC-Ca improved calcium absorption in serum level significantly(p<0.05). Moreover,the bone index showed the bioavailability in PHC-Ca group(p<0.05). Conclusion:PHC-Ca prepared from shrimp shell could be promote calcium absorption,its bioavailability was better than same calcium content of calcium citrate and shrimp shell powder,which could be used as sources of dietary calcium supplement.

shrimp shell;protein hydrolysate-citrate calcium(PHC-Ca);bioavailability

2015-12-22

張文靜(1990-)，女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品加工利用方面的研究，E-mail:zwj323@sina.com。

陳舜勝(1956-)，男，碩士，教授，主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究，E-mail:sschen@shou.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471685)；國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD28B05);融合海洋食品科學(xué)的海洋生物藥物(B5201120040);上海市2015高校內(nèi)涵建設(shè)項(xiàng)目(A2018150009)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)10-0360-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.066