郭宗凱?。ㄉ綎|省濰坊市高密乳肉兼用牛良種繁育改良中心 261500)
雞傳染性支氣管炎分離毒株病理組織學(xué)試驗(yàn)
郭宗凱(山東省濰坊市高密乳肉兼用牛良種繁育改良中心261500)
雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種急性、高度接觸傳染性、病毒性呼吸道疾病。該病的主要特征是:病雞咳嗽、打噴嚏、氣管啰音;腎臟腫大、蒼白,輸尿管擴(kuò)張、有大量尿酸鹽沉積,外觀呈現(xiàn)典型的“花斑腎”。IBV自然感染通常在48h內(nèi)出現(xiàn)癥狀;人工接種后24h到7d始終可從雞氣管、腎、法氏囊中分離出病毒,不同日齡、品種和性別的雞均易感,雛雞常由于呼吸道或腎臟感染而引起死亡;幼雞流鼻涕;蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和蛋的品質(zhì)下降,給世界養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。本試驗(yàn)是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室攻毒雞各器官的病理切片進(jìn)行觀察,提供其動(dòng)態(tài)病理學(xué)變化,為本病發(fā)病機(jī)制的研究提供初步的依據(jù)。
1.1病料來(lái)源病料來(lái)源:經(jīng)培養(yǎng)增殖后獲得的6株毒株感染雞,取相應(yīng)病變嚴(yán)重組織病料,進(jìn)行福爾馬林溶液固定。
1.2試驗(yàn)儀器生物病理切片機(jī)QPJ-1B,高級(jí)切片石蠟(熔點(diǎn)為54~60)℃,電熱恒溫水浴槽,六聯(lián)電子調(diào)溫萬(wàn)用電爐,電熱恒溫箱,光學(xué)顯微鏡OLYMPUS CH-2,載玻片。
1.3固定液配制及HE染液配制(1)10%福爾馬林固定液:甲醛(40%)10ml、蒸餾水90ml配制而成。(2)10%中性福爾馬林固定液:甲醛100ml、稱量Na2HPO4·12H2O 39.5g、NaH2PO4·2H2O 10.95g,加蒸餾水至1000ml。(3)2.5%戊二醛:0.2M磷酸緩沖液50ml,25%戊二醛水溶液10ml,雙蒸水加至100ml。(4)蘇木素染液:蘇木素0.9g、無(wú)水乙醇10ml、明礬15g、黃色氧化汞0.5g、蒸餾水。(5)伊紅染液:伊紅2g、蒸餾水100g。(6)l%鹽酸酒精:75%酒精99ml、37%濃鹽酸1ml。(7)蘇木素染液配制:將蘇木素0.9g溶于裝有無(wú)水乙醇10ml的1000ml燒杯中,將明礬15g溶于200ml蒸餾水中,然后將二者混合,放在電爐上加熱,至沸騰,關(guān)掉電源,加入0.5g黃色氧化汞后,轉(zhuǎn)入冷水中迅速冷卻,取出靜止過(guò)夜,過(guò)濾。
2.1取材分別采取攻毒后4d、7d、15d病死雞的腎臟、肺臟、腺胃,選好切面,將其用手術(shù)刀進(jìn)一步修成便于包埋的小塊。以縱切為主,切面要修平整 。用生理鹽水洗掉組織上的血塊、污物、粘液等雜質(zhì)。
2.2水洗將固定好的組織塊由廣口瓶中取出,用一層紗布包好,將每一組做好標(biāo)記,放于大燒杯中,放在自來(lái)水水流下緩慢沖洗1d,以除去組織中的固定液。
2.3脫水將組織塊放入50%乙醇中浸泡1.5h,再放入70%乙醇進(jìn)行過(guò)夜,之后放入80%乙醇中浸泡1.5h,依次類推放入90%、95%、100%乙醇分別浸泡1.5h,最后進(jìn)行透明處理。
2.4透明與浸蠟將脫水后的組織塊依次浸入二甲苯中進(jìn)行透明。透明時(shí)間不宜太長(zhǎng),20min為宜,然后將透明好的組織塊,分好組放于58℃的電熱恒溫箱中依次浸入石蠟(如附表)。
附表 透明時(shí)間、浸蠟時(shí)間
2.5包埋浸蠟完成后,即做成包有組織的蠟塊。將熔化的石蠟III倒入折好的紙盒內(nèi),再用熱的鑷子將組織塊轉(zhuǎn)入紙盒中。待石蠟結(jié)殼,將紙盒輕輕平穩(wěn)拿起,放在陰涼處過(guò)夜。
2.6修蠟塊將凝固好的蠟塊進(jìn)行修正。將包埋時(shí)蠟塊的底面修成長(zhǎng)方形或正方形。將有組織的一面按組織塊所在的位置,保留組織周圍大約5mm的邊緣。修好的蠟塊做好標(biāo)記,并粘在小木塊上。
2.7切片、展片與烘片將粘好木塊的蠟塊放在切片機(jī)上,調(diào)整好蠟塊的位置,勻速轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī),當(dāng)切出完整而連續(xù)的切片時(shí),用干燥的毛筆將切片從切片刀上取下,光亮面向下平鋪于42℃的恒溫水浴箱中,等待蠟帶上的細(xì)小皺折通過(guò)酒精的張力伸開、展平,然后用載玻片撈取完整的無(wú)皺褶的切片,置于載玻片中間偏左的位置。將水分稍晾干后,即刻放入60℃的烘烤箱中烘烤30min,使切片粘到載玻片上。
2.8HE染色(1)二甲苯去蠟(經(jīng)2次)5~10min。(2)無(wú)水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1~2min,然后蒸餾水洗3min(換數(shù)次)。(3)蘇木紫液染色約3~5min(視染液種類和著色情況增減)。(4)水洗;1%酸性乙醇或1%鹽酸分化,顯微鏡下控制。(5)流水浸洗至少15min,至細(xì)胞核呈藍(lán)色。也可短時(shí)水洗后,浸于40℃溫水使核變藍(lán)。(6)伊紅液染0.5~1min后,95%乙醇2次,無(wú)水乙醇2次,約1~2min/次。(7)苯酚二甲苯(1∶3)5min。(8)二甲苯2次,3~5min/次。(9)用中性樹膠或DPX以蓋片封片,貼標(biāo)簽。
2.9封固觀察將染好色的切片由染色缸中取出后,在組織上滴少許的樹膠,然后用蓋玻片從一側(cè)開始蓋片,樹膠凝固后即可進(jìn)行觀察。
通過(guò)觀察,分離自山東的6株雞傳染性支氣管炎病毒,可引起雞發(fā)病。引起的雞傳染性支氣管炎,主要病理變化發(fā)生在氣管、肺臟、腎臟、腺胃,肝臟也有部分病變。肺臟主要表現(xiàn)為出血、淤血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn);腎臟主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞腫脹、炎性細(xì)胞局灶性增生、核碎裂、核溶解;腺胃平滑肌間隙變寬、有淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)和大量上皮細(xì)胞壞死、腺體上皮細(xì)胞增生,管中有脫落的上皮細(xì)胞,腺體下平滑肌層被水腫液分隔,固有層水腫、有多量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。毛細(xì)血管充血、腺體上皮細(xì)胞大量空泡化,部分心肌細(xì)胞空泡化,腺腔中有黏液、脫落的腺細(xì)胞及單核細(xì)胞,并有大量的腺細(xì)胞壞死、脫落、崩解。在病變嚴(yán)重的病例,病變可以深入到平滑肌層,出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性變性蠟樣壞死。肝臟主要表現(xiàn)為淤血,肝索紊亂,肝小葉界限不清。
由于IBV的血清型很多,又具有高度傳染性,雞群同時(shí)感染不同毒株和使用弱毒疫苗發(fā)生基因重組而不斷變異,使IBV侵害雞體的靶器官也發(fā)生了變換。目前對(duì)IBV的研究很多,而關(guān)于腺胃變型IBV毒株的致病力和引起各器官的動(dòng)態(tài)病理學(xué)變化,僅在山東地區(qū)有少許報(bào)道。一般認(rèn)為腎型IBV主要靶器官為腎臟,主要靶細(xì)胞為腎小管上皮細(xì)胞,引起間質(zhì)性腎炎的變化,至于其他組織器官中病毒的定位和分布則不太清楚。同時(shí)試驗(yàn)中組織學(xué)觀察表明,用6株IBV分離株對(duì)雞攻毒后,首先出現(xiàn)呼吸道癥狀,腺胃癥狀出現(xiàn)在肺臟、腎臟之后,其他一些器官也出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。 病毒侵害呼吸器官后,引起氣管水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn);肺臟出血,水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡壁增厚;然后引起腎的損傷,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,炎性細(xì)胞灶狀增生,核溶解,核碎裂等,證實(shí)IBV首先會(huì)引起呼吸道的癥狀,之后會(huì)引起腎臟的病變。
S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B
1007-1733(2016)08-0033-02
2016-04-25)