王　瑤， 楊　彪， 李　卓*

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安　710077； 2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科； *通訊作者，E-mail：Lizhuo721@163.com)

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蜂膠對大鼠實(shí)驗性脂肪肝的療效及其機(jī)制

王瑤1， 楊彪2， 李卓1*

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安710077；2西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科；*通訊作者，E-mail：Lizhuo721@163.com)

目的觀察蜂膠對大鼠實(shí)驗性脂肪肝的療效，并分析其作用原理。方法50只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、蜂膠低劑量組、高劑量組、易善復(fù)組。除正常組外，其余各組采用喂食高脂乳液(1 ml/100 g)+喂食含56%酒精的酒溶液(1 ml/100 g)+腹腔注射10%的CCl4菜籽油溶液(0.08 ml/100 g)的方法，使大鼠產(chǎn)生脂肪肝。所有大鼠于末次給藥后禁食16 h，股動脈取血，檢測血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平；計算肝臟器系數(shù)，做肝組織病理學(xué)檢驗。結(jié)果利用喂食高脂乳液+喂食56%的酒溶液+腹腔注射CCl4菜籽油溶液的方法，可使大鼠產(chǎn)生脂肪肝，完成實(shí)驗?zāi)Ｐ徒?。相對于模型組，蜂膠高劑量組的TG、AST、TC、ALT、FFA水平下降明顯(P<0.05)，且效果優(yōu)于低劑量組，與易善復(fù)組接近；與模型組比較，蜂膠高劑量組的血清炎癥因子水平(IL-6、IL-8、TNF-α)也明顯降低(P<0.05)；蜂膠高劑量組的肝臟器系數(shù)與模型組比較下降明顯(P<0.05)，病理結(jié)果也顯示肝細(xì)胞的水腫和壞死現(xiàn)象減輕，脂肪空泡減少。結(jié)論蜂膠對大鼠脂肪肝有明顯的療效,其作用機(jī)制可能與影響血清炎癥因子水平具有一定的關(guān)聯(lián)。

蜂膠；脂肪肝；炎癥因子；高脂乳液;大鼠

蜂膠具有多種藥理功效，例如：抗腫瘤、抗菌消炎、抗病毒、降血糖、保護(hù)肝臟等[1]。近年來，國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的專家學(xué)者對其保肝功效也展開了廣泛的研究，并取得了一定成果。然而，蜂膠在脂肪肝治療過程中的作用原理尚不明晰。Albukhari等[2]認(rèn)為蜂膠中的咖啡酸苯乙酯能通過保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，抑制脂質(zhì)過氧化，增強(qiáng)抗氧化酶的方式保護(hù)肝臟。Kart等[3]發(fā)現(xiàn)蜂膠能通過降低活性氮和恢復(fù)谷胱甘肽水平的方式對抗癌藥物順鉑誘導(dǎo)的肝毒性，起到保肝作用。目前，關(guān)于脂肪肝誘發(fā)因素的研究越來越集中于細(xì)胞因子分泌異常這一熱點(diǎn)上[4-6]。因此，本研究觀察蜂膠對大鼠脂肪肝的治療作用及對血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、游離脂肪酸(FFA)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α) 的影響研究，探討了蜂膠在脂肪肝中的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗動物

50只雄性Wistar大鼠，SPF級，體重180-220 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，動物合格證號：SYXK(陜)2014-005。

1.2主要試劑和儀器

CCl4(成都科龍試劑廠，20141104)；易善復(fù)(北京賽諾菲安萬特制藥公司，20140812)；56°二鍋頭酒(北京二鍋頭酒業(yè)公司，XK16-030354)；羧甲基纖維素鈉(上海三浦化工，20140911)；膽固醇(成都科龍化工試劑廠，20150305)；吐溫-80(成都科龍化工試劑廠，20150402)；丙基硫嘧啶(上海復(fù)星朝暉藥業(yè)有限公司，141105)；丙二醇(天津市大茂化學(xué)試劑廠，20141128)；脫氧膽酸鈉(上海Solarbio公司，20140611)；磁力攪拌器(上海KEEZO公司，KMS-181E)；全自動生化儀(美國Beckman公司，AU5800)；酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，Multiskan FC)。1.3蜂膠的純化實(shí)驗

粗制蜂膠經(jīng)冷凍后粉碎，用10倍量的75%乙醇攪拌提取24 h，過濾，濾液在-20 ℃冷凍10 h，300目濾布過濾除蠟，在-10 ℃重復(fù)3次冷凍除蠟工藝，然后加溫至60 ℃，加適量活化了的活性炭攪拌1 h脫鉛，真空濃縮脫水之后進(jìn)行冷卻。得到的精制蜂膠含48%的蜂膠提取物，以及15%的黃酮，符合2009年《蜂膠國家標(biāo)準(zhǔn)》(標(biāo)準(zhǔn)編號為GB/T24283-2009)。使用時以生理鹽水10倍溶解。

1.4高脂乳液的制備

燒杯中放入20 g豬油，用磁力攪拌器進(jìn)行加熱攪拌，升溫至100 ℃，投入膽固醇8 g，完全溶解后滴入吐溫-80 20 ml以及丙基硫嘧啶0.6 g，攪拌均勻呈油狀；另一燒杯中放入丙二醇20 ml、蒸餾水130 ml，加熱至60 ℃，投入脫氧膽酸鈉1.2 g，攪拌均勻呈水相。冷卻后將水相加入油相，攪拌混勻制成高脂乳液。其中豬油含量10%、膽固醇含量4%、膽酸鈉含量0.6%、丙硫氧嘧啶含量0.3%。

1.5脂肪肝大鼠模型的建立及治療

大鼠隨機(jī)分正常組、模型組、易善復(fù)組(250 mg/kg)、蜂膠高劑量組(250 mg/kg)、蜂膠低劑量組(125 mg/kg)，每組各10只。每日下午除正常組以外的其余大鼠都要喂食高脂乳液(1 ml/100 g)喂藥1 h后再對其喂食酒精含量為56%的酒溶液(1 ml/100 g)；另除正常組外，其余各組大鼠隔天腹腔注射10%的CCl4菜籽油溶液(0.08 ml/100 g)，正常組以等容積生理鹽水注射于相同部位[7]。每日上午大鼠進(jìn)行灌胃給藥，周期為18 d。正常組和模型組以羧甲基纖維素鈉混懸液灌胃，給藥體積為1 ml/100 g；易善復(fù)組給藥劑量為250 mg/kg，給藥體積為1 ml/100 g；蜂膠高劑量組給藥劑量為250 mg/kg，給藥體積為1 ml/100 g；蜂膠低劑量組給藥劑量為125 mg/kg，給藥體積為1 ml/100 g。

1.6血清生化指標(biāo)檢測

末次給藥后大鼠禁食16 h，稱體重，股動脈取血，Beckman AU5800全自動生化儀對AST、ALT、TG、TC、FFA水平進(jìn)行檢測，試劑均購自美國Beckman公司。AST和ALT的檢測方法為連續(xù)檢測法；TG、TC和FFA的檢測方法為酶法。

1.7血清炎癥因子水平檢測

Thermo酶標(biāo)儀檢測IL-6、IL-8、TNF-α水平，試劑盒均購自上海江萊生物科技有限公司。操作方法：準(zhǔn)備試劑、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品→加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃反應(yīng)30 min→洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37 ℃反應(yīng)30 min→洗板5次，加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min→加入終止液→15 min之內(nèi)450 nm測量OD值→計算。

摘除大鼠肝臟，稱重，計算肝臟器系數(shù)，肝臟器系數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%，截取一部分肝左葉用10%甲醛固定，HE染色觀察。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS18.0軟件進(jìn)行，正態(tài)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，偏態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后再行分析。利用單因素方差分析法進(jìn)行組別之間的對比，如果方差齊則利用LSD-t檢驗法進(jìn)行組別之間的對比，如果方差不齊則利用Tamhane’s T2檢驗法進(jìn)行兩兩對比。所有結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠一般情況

正常組大鼠飲食正常、體重增加、動作敏捷，其余各組在造模后逐漸出現(xiàn)不同程度的飲食減少、體重下降、不喜活動等現(xiàn)象。大多數(shù)大鼠在進(jìn)行酒精喂食之后出現(xiàn)行走困難、動作遲鈍、精神不振等癥狀。在造模末期，大鼠偶見醉酒表現(xiàn)，開始對酒精產(chǎn)生耐受。

2.2生化指標(biāo)變化

相較于正常組，模型組血清TG、ALT、TC、AST、FFA明顯增加(P<0.05)；相較于模型組，蜂膠高劑量和易善復(fù)能組的大鼠血樣各項指標(biāo)得到明顯改善(P<0.05)；相較于易善復(fù)組，除FFA外其他指標(biāo)蜂膠高劑量組并未出現(xiàn)明顯差異(P>0.05，見表1)，這提示兩組之間具有相同的治療效果。

表1各組大鼠血清AST、ALT、TG、TC、FFA測定比較(n=10)

Table 1Comparison of serum AST, ALT, TG, TC and FFA among five groups(n=10)

組別 ALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)FFA(mmol/L)正常組93.9±11.3164.6±8.91.48±0.331.87±0.450.81±0.24模型組145.4±19.3#172.2±15.43.56±1.22#2.93±2.51#2.02±1.03#易善復(fù)組112.9±20.4#*162.6±54.6*2.12±0.71#*2.08±1.48#*1.24±0.98#*蜂膠低劑量組125.0±36.8*▲164.1±42.22.94±1.28▲2.17±1.501.65±0.52*▲蜂膠高劑量組111.1±41.0*159.4±58.5*2.31±0.65*1.96±1.14*1.52±0.79*▲

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與易善復(fù)組比較，▲P<0.05

2.3相關(guān)炎癥因子改變

與模型組比較，蜂膠高劑量組和易善復(fù)組大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α水平的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中蜂膠高劑量組降低IL-6、IL-8和TNF-α水平的效果優(yōu)于易善復(fù)組(P<0.05，見表2)，接近正常組。

2.4大鼠肝質(zhì)量及臟器系數(shù)變化

與正常組比較，模型組大鼠的肝質(zhì)量及肝臟器系數(shù)顯著增高(P<0.05)，表明模型組大鼠肝臟明顯腫大，提示造模成功。相較于模型組，在肝臟器系數(shù)的抑制效果上來說，蜂膠高劑量組和易善復(fù)組兩組大鼠具有明顯的優(yōu)勢，并且這兩個組之間沒有明顯的差異(P>0.05，見表3)。

表2各組大鼠IL-6,IL-8,TNF-α比較(n=10)

Table 2Comparison of IL-6,IL-8 and TNF-α among five groups(n=10)

組別 IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)TNF-α(ng/ml)正常組1.48±0.752.16±0.9234.48±10.33模型組2.75±0.82#4.21±1.54#52.56±4.25#易善復(fù)組2.02±0.96#*2.66±1.06*38.12±12.71*蜂膠低劑量組1.97±0.88*3.52±2.01▲41.94±13.28*蜂膠高劑量組1.81±0.69*▲3.23±1.25*▲32.31±14.65*▲

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與易善復(fù)組比較，▲P<0.05

表3各組大鼠肝重及臟器系數(shù)測定比較(n=10)

Table 3Comparison of liver weight and liver organ coefficient among five groups(n=10)

組別體質(zhì)量(g)肝質(zhì)量(g)肝臟器系數(shù)正常組 300±3910.36±2.033.43±0.39模型組 225±33#11.62±1.74#5.19±0.57#易善復(fù)組230±3210.10±2.03*4.39±0.68*#蜂膠低劑量組222±2711.22±1.66▲5.07±0.67▲蜂膠高劑量組223±2810.76±2.034.73±0.73*

與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與易善復(fù)

組比較，▲P<0.05

2.5大鼠肝臟病理改變

正常組大鼠的肝細(xì)胞是多角形的，圓形的細(xì)胞核處于細(xì)胞中央，胞質(zhì)著色嗜酸性。以中央靜脈為中心肝細(xì)胞呈現(xiàn)出放射形的整齊排列，并未發(fā)現(xiàn)較為嚴(yán)重的脂肪沉淀(見圖1A)。模型組大鼠的肝細(xì)胞則發(fā)生了彌漫性的中度脂肪變性，在胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不一的脂肪空泡，在胞質(zhì)的一側(cè)出現(xiàn)了較大的空泡，細(xì)胞核的周圍則密密麻麻的分布著眾多小空泡，在匯管區(qū)能夠辨識到炎性的細(xì)胞浸潤，細(xì)胞出現(xiàn)水腫和壞死現(xiàn)象(見圖1B)。易善復(fù)組大鼠的脂肪空泡明顯變少，但是，在匯管區(qū)仍然能夠觀察到炎性的細(xì)胞浸潤(見圖1C)。蜂膠高劑量組和蜂膠低劑量組可見輕度的細(xì)胞水腫，脂肪空泡減少，匯管區(qū)未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(見圖1D、1E)。

A.正常組　　　　　　B.模型組　　　　　C.易善復(fù)組　　　　D.蜂膠高劑量組　　　E.蜂膠低劑量組 圖1　大鼠肝臟病理學(xué)改變 (HE,×200)Figure 1　Pathological changes of liver in rats in different groups (HE,×200)

3　討論

脂肪肝是指由多病因誘發(fā)的肝細(xì)胞脂肪過量沉積或者血脂的代謝功能出現(xiàn)異常等一系列的病變[8]。脂肪肝是引發(fā)動脈硬化、冠心病以及腦溢血等疾病的重要因素，其治療以防治結(jié)合最為重要[9]。到目前為止，尚無治療脂肪肝的特效藥，西醫(yī)多用降脂藥物來代替治療。一些調(diào)脂藥物雖然對脂肪肝治療有效，但卻存在潛在的肝毒性，會加重肝臟損傷[10]。因此，如果能夠找到一種既有調(diào)脂功能又有保肝功能的藥物，將會為廣大的脂肪肝患者帶來福音。

蜂膠中含有有機(jī)酸類、烯萜類化合物、黃酮、芳香揮發(fā)油等豐富的營養(yǎng)成分，具有廣泛的生理和藥理作用，能起到保護(hù)肝臟的效果，為一種防治脂肪肝的首選良藥[11]。但目前國內(nèi)外對蜂膠在脂肪肝中調(diào)節(jié)機(jī)制的相關(guān)報道較少。因此，本研究建立了復(fù)合型脂肪肝的動物模型，并用蜂膠提取物進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：蜂膠在降低血清TC、ALT、TG、AST指標(biāo)以及肝細(xì)胞脂肪空泡方面具有明顯效果，并且可以抑制FFA的產(chǎn)生，與此同時，實(shí)驗還發(fā)現(xiàn)蜂膠在消炎方面也具有一定的功效，能夠有效抑制血清中炎癥因子(IL-6、IL-8、TNF-α)的作用。蜂膠中有可能具有某種活性成分，能對已破壞的肝細(xì)胞膜進(jìn)行生理性修復(fù)，減少氧激酶與脂質(zhì)的過氧化，從而更好地降低了炎癥反應(yīng)。

近幾年，相關(guān)領(lǐng)域的研究專家將更多的精力傾注于細(xì)胞因子與肝病的關(guān)聯(lián)性研究上，在肝細(xì)胞脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化以及肝硬化的病史發(fā)展中，細(xì)胞因子起到了決定性的因素[12-15]。

肝臟在脂肪變性初次打擊后，由于自然殺傷T細(xì)胞的耗盡，使具有抗炎作用的Th-2細(xì)胞因子相對不足，進(jìn)而使肝臟長期處于炎癥反應(yīng)環(huán)境中，NF-κB被激活，多種炎癥因子如TNF-α、IL-8、IL-6產(chǎn)生增加，使肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡，并引起大量炎癥細(xì)胞浸潤。當(dāng)肝臟不能拮抗上述過程時，最終導(dǎo)致脂肪性肝炎的發(fā)生。在肝臟，TNF-α由枯否細(xì)胞分泌，是肝臟損害過程中出現(xiàn)最早的炎癥因子，在單純性脂肪肝進(jìn)展為脂肪性肝炎中扮演著重要角色[16]。

IL-6參與肝臟炎癥損害、肝臟脂肪氧化和三酰甘油的清除。而高胰島素血癥可以引起肝臟脂肪酸聚集，形成肝脂舫變性。臨床上用抑制IL-6活性的方法，提高機(jī)體對胰島素的敏感性，進(jìn)而防治脂肪肝的發(fā)生發(fā)展[17]。Yamaguchi等[18]用托珠單抗(Tocilizumab，IL-6受體的特異性抗體)干預(yù)脂肪肝小鼠，發(fā)現(xiàn)肝IL-6信號的嚴(yán)重抑制可能促進(jìn)脂肪肝的進(jìn)展。Kroy等[19]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6/糖蛋白130信號傳導(dǎo)缺陷的小鼠更易發(fā)生肝脂肪變性及損傷，促進(jìn)脂肪肝的進(jìn)展。

目前有關(guān) IL-8在NAFLD中作用及其可能機(jī)制的研究較少[20]。肝臟脂肪變性可使IL-8產(chǎn)生增加，IL-8活化并趨化中性粒細(xì)胞，參與肝細(xì)胞的炎癥損傷[17]。此外，F(xiàn)FA與炎癥因子的相互調(diào)節(jié)在脂肪肝中也有非常重要的意義[21]，當(dāng)發(fā)生脂肪肝病變時，血樣檢測往往會呈現(xiàn)出血清FFA指標(biāo)上升的現(xiàn)象。

脂肪肝的發(fā)病機(jī)制在國際上一直存在較多的爭議，炎癥因子在其中所占的比例尚不完全清楚。此次試驗表明，雖然蜂膠在抑制炎癥因子(FFA、IL-6、IL-8、TNF-α)的影響上具有一定的功效，改善肝臟的炎性損傷和脂肪變性程度，有助于肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)正常，但蜂膠中具體哪些活性成分起到主要作用，控制了炎癥因子是否就可以預(yù)防脂肪肝的發(fā)生等問題還有待大規(guī)模的實(shí)驗研究。

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Research on efficacy of propolis in rats with fatty liver and its mechanism

WANG Yao1，YANG Biao2，LI Zhuo1*

(1DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity,Xi’an710077,China;2DepartmentofOrthopaedics,FirstAffiliatedHospitalofXi’anMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:Lizhuo721@163.com)

ObjectiveTo explore the therapeutic effect of prololis on fatty liver in rats and its mechanism.MethodsFifty rats were randomly divided into normal group, model group, polyene phosphatidylcholine group, high dose of propolis group, low dose of propolis group(n=10 in each group). The fatty liver model was induced by feeding high fat emulsion and 56% alcohol and injecting carbon tetrachloride in abdominal cavity. After the last administration and fasting for 16 h, the blood was collected from the femoral artery to detect the level of aspertate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), triglyceride(TG), cholesterol(TC),free fatty acids(FFA), interleukin-6(IL-6), interleukin-8(IL-8) and tumor necrosis factor α(TNF-α). The liver was removed to calculate the liver organ coefficient and observe the pathological changes.ResultsThe fatty liver rat model was established successfully. Compared with model group, the blood levels of AST, ALT, TG, TC, FFA in high dose group reduced significantly(P<0.05).The effect was better in high dose group than in low dose group, but close to that in polyene phosphatidylcholine group. Compared with model group, the blood levels of IL-6, IL-8 and TNF-α in high dose group decreased significantly(P<0.05). The liver organ coefficient in high dose group was lower than in model group(P<0.05). The edema and necrosis in hepatic cells were rare in high dose group, and the fat vacuoles decreased.ConclusionPropolis has obvious therapeutic effect on fatty liver in rats, which may be related to the changes of serum levels of inflammatory factors.

propolis;fatty liver;inflammatory factor;high fat emulsion;rats

陜西省教育廳專項科研計劃資助項目(2010JK803)

王瑤，女，1984-04生，碩士，主管技師，講師，E-mail：95244556@qq.com

2016-05-29

R575

A

1007-6611(2016)08-0693-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.004