張　瑞， 朱　娜， 馬　靜， 張文平， 劉近春， 原麗莉*

(1山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院消化內(nèi)科，太原　030032； 2山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院； 3山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院； 4山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院； *通訊作者，E-mail:Dangyuan831@sina.com)

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一種潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌小鼠模型的建立

張瑞1,2， 朱娜1， 馬靜3， 張文平4， 劉近春3， 原麗莉1*

(1山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院消化內(nèi)科，太原030032；2山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院；3山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院；4山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；*通訊作者，E-mail:Dangyuan831@sina.com)

目的建立一種簡單易行的潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌小鼠模型。方法5周齡C57BL/6J雄性小鼠被分為實驗組(n=10)和對照組(n=7)。實驗組小鼠腹腔注射致癌劑氧化偶氮甲烷(AOM)10 mg/kg后給于致炎劑2%葡聚糖硫酸鈉(DSS)飲水4 d，之后換為普通飲水17 d為1個周期，共3個周期結(jié)束；對照組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。解剖鏡大體觀察結(jié)腸，并對結(jié)腸進(jìn)行炎癥評分、黏膜息肉評分和腫瘤病理評分，評分結(jié)果采用非配對t檢驗，檢驗水準(zhǔn)取ɑ=0.05。結(jié)果實驗組小鼠腹腔注射AOM后無明顯變化，給予DSS后有50%小鼠出現(xiàn)血便，且逐漸加重，試驗結(jié)束時小鼠表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍，活動減少，出現(xiàn)血便的小鼠均有脫肛。對照組小鼠無異常表現(xiàn)。實驗組小鼠較對照組體重增長明顯減緩。試驗結(jié)束時，所有實驗組小鼠遠(yuǎn)端及中段大腸出現(xiàn)不典型增生/癌變，大體解剖鏡炎癥評分、息肉評分和病理切片腫瘤評分均顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論致癌劑AOM和致炎劑DSS可誘導(dǎo)小鼠建立潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的結(jié)腸癌模型。

潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌；氧化偶氮甲烷；葡聚糖硫酸鈉；動物模型

結(jié)腸癌是常見的發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3位，近年來呈現(xiàn)出上升趨勢。結(jié)腸癌的發(fā)病與遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)，炎癥性腸病患者、結(jié)腸息肉患者、有膽囊切除史的患者、男性肥胖者等為易感人群。炎癥性腸病，如潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病是腸道的慢性炎癥狀態(tài)，常常伴隨結(jié)腸癌發(fā)病率的增加。潰瘍性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸癌發(fā)生率是正常人群的5.7倍，且發(fā)病年齡提前[1]。隨著我國飲食結(jié)構(gòu)的改變，高熱量、高蛋白、低纖維的食物攝入增多，食物中潛在的化學(xué)致癌劑容易誘發(fā)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。動物實驗和流行病學(xué)實驗研究表明，結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展與結(jié)腸的炎癥程度、炎癥范圍及病程長短有密切關(guān)系，反復(fù)的炎癥發(fā)作是惡性腫瘤形成的重要原因之一，但是其中的分子生物學(xué)，免疫病理學(xué)及遺傳學(xué)等機(jī)制卻不明確[2，3]，因而，探討結(jié)腸炎發(fā)展為結(jié)腸癌的病理機(jī)制將有助于相關(guān)疾病的預(yù)防及治療。由炎癥向腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程是研究腫瘤發(fā)病機(jī)制，因此建立炎癥基礎(chǔ)上的腫瘤模型對于研究這一過程非常重要。許多研究表明，腸道的慢性反復(fù)性炎癥發(fā)作如潰瘍性結(jié)腸炎會明顯地增加結(jié)腸癌的發(fā)生率, 而建立結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌動物模型是對于其中的機(jī)制研究及治療方法探索的基礎(chǔ)。本研究在小鼠腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)基礎(chǔ)上，再給予飲用濃度為2%的葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)飲用水來建立潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌動物模型。

1　材料和方法

1.1小鼠及主要試劑

5周齡C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量15-20 g,購于北京海斯萊克實驗動物中心。小鼠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)實驗動物中心，自由飲水、飼以普通顆粒飼料。氧化偶氮甲烷(AOM)購于美國Sigma公司；葡聚糖硫酸鈉(DSS)，分子量36 000-50 000，購于MP Biomedical公司。

1.2小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型的制作

5周齡C57BL/6J雄性小鼠17只被隨機(jī)分實驗組(10只)和對照組(7只)。參照文獻(xiàn)[3]的方法，實驗組小鼠先以AOM 10 mg/kg體重腹腔注射1次，1周后以2% DSS飲用水飲用4 d，之后以普通飲用水連續(xù)飲用17 d為1個周期；重復(fù)3個周期；對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，后普通飲食喂養(yǎng)。

1.3小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型臨床表現(xiàn)觀察

試驗期間，每天觀察動物健康狀況，包括毛色、活動、糞便性狀，有無肉眼血便及脫肛等情況，每周測量小鼠體重1次。實驗期間不禁食。

1.4小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型的指標(biāo)評價

試驗結(jié)束后，乙醚麻醉處死小鼠，分離肛門至回盲部連接處整段大腸。沿腸縱軸切開大腸，生理鹽水沖洗，測量大腸的長度。解剖鏡大體觀察，按照文獻(xiàn)[4]的方法對結(jié)腸進(jìn)行炎癥評分和黏膜息肉評分[4]。

結(jié)腸炎癥評分標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)臨床癥狀及結(jié)腸出現(xiàn)以下每一項時各記1分，如充血、出血、狹窄、潰瘍、血便、黏液、腹瀉和粘連，加上結(jié)腸距肛門1 cm處或結(jié)腸病變部位最厚處的厚度(mm)得分。

結(jié)腸息肉評分系統(tǒng)是根據(jù)觀察到結(jié)腸的息肉數(shù)目來進(jìn)行評價：無息肉為0分，1-3個孤立息肉為1分，4個或以上孤立息肉為2分，幾個息肉融合成片或隆起呈塊狀為3分。之后給予10 %中性甲醛對結(jié)腸進(jìn)行固定，經(jīng)包埋、切片、HE染色，按照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行顯微鏡下腫瘤病理評分。

腫瘤評分標(biāo)準(zhǔn)基于以下3個方面：隱窩(正常為0分，杯狀細(xì)胞減少為1分；分支狀、不規(guī)則、隱窩腔擴(kuò)張為2分；萌芽復(fù)合體為3分)；上皮(正常為0分，過度增生或畸形隱窩病灶為1分，輕度不典型增生：核仁增大、輕度深染、細(xì)胞核秘籍分層現(xiàn)象為2分，高度不典型增生：細(xì)胞核分層、重度深染、多形性、核極性消失為3分)，黏膜下浸潤(無為0分，有為1分)。動物尸體由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心統(tǒng)一處理。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

所以數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用非配對t檢驗，檢驗水準(zhǔn)取ɑ=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1小鼠結(jié)腸癌發(fā)展過程中臨床表現(xiàn)觀察

小鼠皮下注射AOM后其攝食量無明顯變化，自主活動如常，排便正常，體重?zé)o減輕。隨后給予DSS，小鼠的攝食量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，活動也逐漸減少。在第1個試驗周期，實驗組小鼠在給予DSS后的第2天有2例出現(xiàn)稀便，第3天有3例小鼠出現(xiàn)血便，第4天增加到5例。2例小鼠有黏液便，血便最長維持5 d后緩解，正常飲水后逐漸恢復(fù)。在第2個試驗周期，給予DSS后第3天實驗組小鼠即有8例出現(xiàn)血便，正常飲水后漸恢復(fù)。在第3個試驗周期，給予DSS后第1天實驗組小鼠即出現(xiàn)血便，第3天所有小鼠均出現(xiàn)血便或黏液血便，最長持續(xù)7 d，改自來水后逐漸緩解。在整個實驗結(jié)束時，出現(xiàn)血便的小鼠均出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象。此時所有的小鼠均反應(yīng)遲鈍，活動減少，動作緩慢不靈。對照組小鼠無異常表現(xiàn)。

2.2小鼠結(jié)腸癌發(fā)展過程中飲食及體質(zhì)量的變化

給予AOM后，實驗組小鼠的進(jìn)食、飲水量與對照組小鼠無明顯差異。而給予DSS后，實驗組小鼠的進(jìn)食、飲水均減少。換用正常飲水后，小鼠進(jìn)食、飲水逐漸恢復(fù)。在第1周期和第3周期飲用DSS期間，實驗組小鼠體重增加低于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001 3和P=0.013)； 在第2周期，兩組小鼠體質(zhì)量增加雖無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但實驗組小鼠仍低于對照組。實驗結(jié)束時，實驗組小鼠體質(zhì)量平均增加程度顯著低于對照組(P=0.004)。

表1不同處理后小鼠體質(zhì)量變化(g)

Table 1Changes of body weight of mice before and after treatment(g)

分組n體質(zhì)量增加(g)第1周期第2周期第3周期整個實驗前后實驗組100.12±0.360.14±0.28-1.32±0.393.8±0.92對照組72.40±0.500.23±0.13 2.20±1.398.1±0.79 t3.930.2472.2833.386 P0.00130.8080.01260.0041

2.3小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌的病理改變

實驗結(jié)束時，實驗組小鼠的大腸與周圍組織粘連加重，腸壁有不同程度的充血、水腫，腸道皺褶減少或消失，腸道質(zhì)地變硬。實驗組小鼠大腸均可見一處或多處直徑5-11 mm息肉樣圓形隆起，大多數(shù)位于結(jié)腸遠(yuǎn)端，其次為結(jié)腸中段，結(jié)腸近口側(cè)沒有腫瘤形成(見圖1)。實驗結(jié)束時的大體解剖鏡炎癥評分及息肉評分結(jié)果顯示，實驗組炎癥評分指數(shù)、息肉評分指數(shù)和顯微鏡下腫瘤評分指數(shù)均顯著高于正常對照組，且有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。病理HE切片，可見對照組腺體結(jié)構(gòu)正常，沒有杯狀細(xì)胞減少，高倍鏡上皮正常，無不典型增生(見圖2A、B)；實驗組腺體排列紊亂，杯狀細(xì)胞減少，隱窩腔擴(kuò)張，分支狀畸形，上皮過度增生，高倍鏡下核仁增大，

細(xì)胞核分層，重度深染，多形性，有黏膜下浸潤(見圖2C、D)。所有實驗組小鼠腸道有不同程度的炎癥表現(xiàn)：滲出、白細(xì)胞浸潤、黏膜潰瘍或壞死等。實驗組有5例(50%)小鼠發(fā)展成結(jié)腸癌，表現(xiàn)為高度不典型增生或早期浸潤癌等。有脫肛的小鼠，大腸息肉樣隆起數(shù)量多，發(fā)生部位多，容易融合成大的腫瘤(見圖1)，病理切片表現(xiàn)較嚴(yán)重，呈白細(xì)胞滲出、浸潤、黏膜潰瘍或壞死、腺體不典型增生及浸潤癌等(見圖2)。

表2小鼠大腸炎癥評分、息肉評分及腫瘤病理評分

Table 2Inflammation score, polyp score and tumor pathological score in colon of mice

分組n大體解剖鏡評分炎癥評分息肉評分顯微鏡下腫瘤評分試驗組105.52±0.941.50±0.27 5.10±0.41 對照組70.71±0.020.14±0.141.13±0.30t4.8424.4827.538P0.00020.0002<0.0001

圖1　小鼠結(jié)腸大體表現(xiàn)及脫肛現(xiàn)象Figure 1　Gross appearance of colon and prolapse phenomenon of mice

A.對照組×40倍　　　　　B.對照組×400倍　　　　　C.實驗組×40倍　　　　　D.實驗組×400倍圖2　不同處理小鼠大腸病理HE染色顯微鏡下表現(xiàn)Figure 2　Pathology of colon in mice after different treatment under microscope after HE staining

3　討論

目前已經(jīng)建立了多種結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌模型，如用IL-10基因敲除小鼠制作的結(jié)腸癌模型[7]，是一類以結(jié)腸炎癥相關(guān)遺傳缺陷為基礎(chǔ)的動物結(jié)腸癌模型，此種小鼠通常在完全無菌的環(huán)境中生長，當(dāng)在有螺桿菌的環(huán)境中飼養(yǎng)時就會逐漸出現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎甚至發(fā)展到結(jié)腸癌。IL-2或Muc2等基因敲除也能造出炎癥性腸病相關(guān)結(jié)腸癌動物模型[8]。通過移植腫瘤細(xì)胞株的方法也可以制作結(jié)腸癌模型，但是難以觀察到由炎癥向腫瘤轉(zhuǎn)化的過程。更常用的是化學(xué)誘導(dǎo)的方法制作的動物模型，如飲水中加入DSS,可在動物身上復(fù)制結(jié)腸炎相關(guān)臨床癥狀、體征及病理學(xué)改變，這些表現(xiàn)與人類潰瘍性結(jié)腸炎相類似，但是單獨(dú)使用DSS時結(jié)腸癌模型成功的比例較低，單獨(dú)使用化學(xué)試劑比如1,2-二甲肼或氧化偶氮甲烷時成癌率不高，且耗時較長[9]。一些研究報道采用結(jié)合飲用DSS水加上注射DMH或AOM制造潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)小鼠結(jié)腸癌模型，可以很好地解決了上述存在的問題[10,11]。

本研究聯(lián)合使用AOM和DSS處理小鼠制造潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌動物模型。AOM是一種結(jié)腸癌致癌劑，它通過細(xì)胞膜和DNA的過氧化，引起結(jié)腸黏膜細(xì)胞的過度增殖。AOM能在嚙齒動物大腸內(nèi)誘導(dǎo)出體征、病理變化方面和人類結(jié)腸癌相似，是一種結(jié)腸基因毒性的致癌劑，被廣泛應(yīng)用于研究嚙齒動物結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制等[12]。DSS是由蔗糖合成的一種硫酸多糖體，通過其細(xì)胞毒性作用干擾腸道淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的關(guān)系，激活腸道的免疫系統(tǒng)，刺激腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，增加中性粒細(xì)胞的集聚，造成潰瘍性結(jié)腸炎的形成，其臨床特點(diǎn)與人類潰瘍性結(jié)腸炎非常相近，是一種非基因毒性的結(jié)腸致癌劑，在嚙齒動物中被廣泛應(yīng)用于制作潰瘍性結(jié)腸炎模型，它是一種能刺激結(jié)腸癌變的炎癥誘導(dǎo)劑[13,14]。

本實驗結(jié)果顯示，聯(lián)合使用AOM和DSS建立的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌模型，與人類潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌在臨床體征及病理變化方面相似，較好地模擬了人類潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)性大腸癌的發(fā)生發(fā)展過程，可被用于結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究。

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Establishment of a mouse model of ulcerative colitis-associated colorectal cancer

ZHANG Rui1,2, ZHU Na1, MA Jing3, ZHANG Wenping4, LIU Jinchun3, YUAN Lili1*

(1DepartmentofGastroenterology,ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030032,China;2SecondClinicalMedicalCollegeofShanxiMedicalUniversity;3FirstClinicalMedicalCollegeofShanxiMedicalUniversity;4SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:Dangyuan831@sina.com)

ObjectiveTo establish a colitis-associated colorectal cancer mouse model.MethodsThe 5-week-old C57BL/6J male mice were randomized into experiment group(n=10) and control group(n=7). The mice in experiment group were intraperitoneally injected with azoxymethane(AOM,10 mg/kg body weight), and then given the water including 2% DSS for 4 d and finally regular water for 17 d. The process repeated 3 times. The mice in control group were given only regular water. The colon was observed under dissecting microscope, and colon inflammation score, mucosal polyp score and pathological score were evaluated and analyzed with the unpairedttest(ɑ= 0.05).ResultsNo obvious changes happened in only AMO-treated mice, but after giving DSS, half of the mice showed the bloody stools and gradually got worse. At the end of experiment, the mice in expriment group showed less activity, and all the mice with bloody stools showed rectal prolapse. The mice in control group had no change. The mice in experiment group showed less weight gain than in control group. At the end of the experiment, all mice showed dysplasia/cancer in middle distal colon in experiment group, and gross anatomy mirror inflammation score, polyp score and pathological tumor rates were significantly higher than in control group(P<0.05).ConclusionAOM followed by DSS can effectively induce the formation of colitis-induced colorectal cancer in mice.

ulcerative colitis-associated colorectal cancer;azoxymethane;dextran sodium sulfate;animal model

山西省留學(xué)人員管理委員會科研基金資助項目(晉留辦發(fā)2010-14-97)

張瑞，男，1969-11生，碩士，副主任醫(yī)師,E-mail：zhangruim@hotmail.com

2016-05-06

R735.35

A

1007-6611(2016)08-0720-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.08.010