肖海涵，范霞，郭明權(quán)，羅婷婷，夏碧麗，何平

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海 200025

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·論著·

A類Ⅰ型清道夫受體調(diào)節(jié)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞抗肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌感染

肖海涵，范霞，郭明權(quán)，羅婷婷，夏碧麗，何平

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與微生物學(xué)系，上海 200025

本研究旨在探討A類Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class A type I，SR-AI)在呼吸道感染常見(jiàn)病原體肺炎克雷伯菌及銅綠假單胞菌感染過(guò)程中的免疫調(diào)節(jié)功能。以肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌臨床分離株與野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞互作，研究SR-AI在吞噬和炎癥反應(yīng)中的作用。熒光染料染色菌體及檢測(cè)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，數(shù)據(jù)顯示SR-AI敲除后巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎克雷伯菌的吞噬能力下降，但對(duì)銅綠假單胞菌的吞噬能力升高。采用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)相關(guān)炎癥因子mRNA水平，發(fā)現(xiàn)SR-AI敲除后肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌刺激巨噬細(xì)胞引發(fā)的炎癥反應(yīng)均增強(qiáng)。結(jié)果表明，SR-AI參與巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎克雷伯菌的吞噬，但不參與對(duì)銅綠假單胞菌的吞噬，且可能抑制了肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌引發(fā)的炎癥反應(yīng)。

小鼠巨噬細(xì)胞；A類Ⅰ型清道夫受體；肺炎克雷伯菌；銅綠假單胞菌；吞噬；炎癥反應(yīng)

A類Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class A type I, SR-AI)是一種主要表達(dá)于機(jī)體巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的三聚體跨膜蛋白受體，也是一種重要的模式分子識(shí)別受體。其胞外結(jié)構(gòu)功能域具有廣泛的配體結(jié)合性，包括細(xì)菌及其病原體相關(guān)模式分子，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、外膜蛋白等，可介導(dǎo)細(xì)胞的吞噬和消化，在宿主防御和天然免疫方面發(fā)揮重要作用[1-4]。肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,K.pneumoniae)為革蘭陰性菌, 屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)克雷伯菌屬；銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)為中等大小的革蘭陰性桿菌，屬假單胞菌屬，是一種機(jī)會(huì)致病菌，廣泛存在于醫(yī)院環(huán)境中[6-7]。兩者均為臨床常見(jiàn)的呼吸道病原體[8-10]，但與SR-AI的相互作用尚不清楚。本研究通過(guò)探討SR-AI與肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌之間的相互作用，了解SR-AI在呼吸道感染中的作用，加強(qiáng)對(duì)機(jī)體天然免疫與呼吸道病原菌相互作用的認(rèn)識(shí)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌自呼吸道感染患者中分離獲得，分別由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院崇明分院檢驗(yàn)科贈(zèng)予，由梅里埃公司VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)儀加以鑒定和驗(yàn)證。

1.1.2巨噬細(xì)胞SR-AI-/-腹腔巨噬細(xì)胞取自6～8周齡SR-AI-/-C57BL/6小鼠，由南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省心血管病與分子干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊惠老師饋贈(zèng)。小鼠為實(shí)驗(yàn)清潔級(jí)。實(shí)驗(yàn)許可證：SYXK(蘇)2008-0004。SR-AI-/-小鼠背景信息見(jiàn)https://www.jax.org/strain/006096及相關(guān)文獻(xiàn)[1]。野生型原代腹腔巨噬細(xì)胞取自與SR-AI-/-小鼠有相同背景的6～8周齡C57BL/6小鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠為實(shí)驗(yàn)清潔級(jí)。生產(chǎn)許可證：SCXK(滬)2007-0005；實(shí)驗(yàn)許可證：SYXK(滬)2008-0038。

1.1.3試劑及耗材主要試劑有DMEM高糖型培養(yǎng)基(Corning，10-013-CVR)、RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，C22400500BT)、胎牛血清(Gibco，10099141)、青/鏈霉素雙抗(Gibco，15140-122)、TriPure Isolation Reagent(Roche，11667165001)、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，#K1622)、Faststart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche，11929100)、DEPC水(Ambion，AM9915G)、巰基乙酸鈉(BD，211716)、LB培養(yǎng)基〔自配，其中NaCl購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司、胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司〕、異丙醇(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、多聚甲醛(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)(碧云天生物技術(shù)公司，ST511)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(碧云天生物技術(shù)公司，C1002)。細(xì)胞培養(yǎng)所用10 cm培養(yǎng)皿、12孔培養(yǎng)板及24孔培養(yǎng)板均購(gòu)自Corning公司。

1.1.4引物合成及序列引物由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站在線引物設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)，Invitrogen上海分公司合成。相關(guān)引物見(jiàn)表1。

1.1.5儀器和設(shè)備主要儀器和設(shè)備有臺(tái)式低溫離心機(jī)(Thermo)、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀(Applied Biosystems)、熒光 定量PCR儀(ABI 7500 Fast)、核酸測(cè)定儀(Nanodrop，Thermo)、激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)、CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)等。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)挑取肺炎克雷伯菌及銅綠假單胞菌單克隆，接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.2.2PI染色PI是一種熒光染料，易與DNA和RNA結(jié)合，在最大激發(fā)波長(zhǎng)535 nm處釋放紅色熒光。PI染色方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，具體如下。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌液，離心收集，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)重懸；60 ℃熱滅活30 min，冷卻后加入PI染料至終濃度為50 g/mL，常溫避光振蕩孵育30 min；離心，PBS洗4次，PBS重懸，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1RT-PCR引物

Tab.1Primers used for RT-PCR

GenePrimerSequence(5'-3')B2mForwardCTGCTACGTAACACAGTTCCACCC(reference)ReverseCATGATGCTTGATCACATGTCACGIL-1βForwardGAAATGCCACCTTTTGACAGTGReverseTGGATGCTCTCATCAGGACATIL-6ForwardTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCCReverseTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCIL-12βForwardTGGTTTGCCATCGTTTTGCTGReverseACAGGTGAGGTTCACTGTTTCT

1.2.3小鼠腹腔巨噬細(xì)胞收集取成年健康雌性野生型和SR-AI-/-小鼠，每只腹腔注射1 mL 5%巰基乙酸鈉溶液，飼養(yǎng)4 d后處死，收集腹腔巨噬細(xì)胞。

1.2.4吞噬菌體實(shí)驗(yàn)將圓形玻片預(yù)先放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，再鋪入小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(每孔2×105個(gè)細(xì)胞)，過(guò)夜培養(yǎng)；將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=20∶1(菌體數(shù)∶細(xì)胞數(shù))比例加入經(jīng)PI染色的菌體，1 000 r/min離心3 min，37 ℃共孵育40 min。4%多聚甲醛固定，DAPI染核后用抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光觀察并計(jì)算吞噬量。

1.2.5PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)水平將細(xì)胞按5×105個(gè)/孔鋪入12孔板，培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，重新加入新鮮培養(yǎng)基，以MOI=20∶1(細(xì)菌數(shù)∶細(xì)胞數(shù))比例加入經(jīng)4%多聚甲醛固定的菌體，37 ℃共培養(yǎng)。在規(guī)定時(shí)間收集經(jīng)細(xì)菌刺激的細(xì)胞，用TriPure Isolation Reagent裂解液裂解，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)抽提總RNA。按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)說(shuō)明書(shū)，將500 ng RNA經(jīng)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別對(duì)白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6及IL-12β基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1SR-AI在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌中的作用

熒光電鏡觀察巨噬細(xì)胞吞噬肺炎克雷伯菌發(fā)現(xiàn)，吞噬后野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞比SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞有更強(qiáng)的紅色熒光。熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析顯示，每個(gè)野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬的菌體平均熒光強(qiáng)度值為12，而每個(gè)SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬的菌體平均熒光強(qiáng)度為8，表明SR-AI可提高巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎克雷伯菌的吞噬能力(圖1A)。

熒光電鏡觀察巨噬細(xì)胞吞噬銅綠假單胞菌發(fā)現(xiàn)，吞噬后SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞比野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞有更強(qiáng)的紅色熒光。熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析顯示，每個(gè)野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬的菌體平均熒光強(qiáng)度值為3，而每個(gè)SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬的菌體平均熒光強(qiáng)度為6，表明巨噬細(xì)胞中SR-AI對(duì)銅綠假單胞菌的吞噬能力沒(méi)有增加作用，反而有潛在的抑制作用(圖1B)。

2.2SR-AI在肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌引發(fā)炎癥反應(yīng)中的作用

在菌體體外刺激巨噬細(xì)胞所引發(fā)炎癥反應(yīng)的研究中，肺炎克雷伯菌刺激野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬8 h后，SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和IL-12β mRNA表達(dá)量明顯高于野生型小鼠。同樣結(jié)果見(jiàn)于銅綠假單胞菌刺激野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞所引發(fā)的炎癥反應(yīng)中，刺激后8 h，SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中

A:K.pneumoniae. B:P.aeruginosa. Blue indicates nucleus, red indicates bacteria.

圖1野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎克雷伯菌及銅綠假單胞菌的吞噬

Fig.1The phagocytosis ofK.pneumoniaeandP.aeruginosaby peritoneal macrophages from wide-type andSR-AI-/-mice

A:K.pneumoniae. B:P.aeruginosa.*P<0.05.

圖2肺炎克雷伯菌或銅綠假單胞菌感染后野生型小鼠和SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中炎癥因子的mRNA水平

Fig.2mRNA levels of inflammatory cytokines in peritoneal macrophages from wide-type andSR-AI-/-mice after infection ofK.pneumoniaeorP.aeruginosa

IL-1β、IL-6和IL-12β mRNA表達(dá)量明顯高于野生型小鼠。由此可見(jiàn)，SR-AI敲除后，肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌刺激腹腔巨噬細(xì)胞導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)增強(qiáng)(圖2)。

3　討論

巨噬細(xì)胞對(duì)病原體的吞噬是天然免疫的重要組成部分，已發(fā)現(xiàn)多種吞噬相關(guān)受體，如Fc受體、整合素、凝集素、甘露糖受體等，與配體結(jié)合后可引起細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)，啟動(dòng)細(xì)胞吞噬[13-14]。SR-AI為一種模式分子識(shí)別受體，與配體結(jié)合被激活后，能發(fā)揮非調(diào)理型吞噬功能，提高細(xì)胞吞噬功能[1-2]。本研究顯示，SR-AI敲除后，巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎克雷伯菌的吞噬能力明顯降低，表明SR-AI能識(shí)別肺炎克雷伯菌并參與巨噬細(xì)胞對(duì)其吞噬。與肺炎克雷伯菌不同，SR-AI敲除后巨噬細(xì)胞對(duì)銅綠假單胞菌的吞噬沒(méi)有減少反而增加，推測(cè)SR-AI可能不參與銅綠假單胞菌的吞噬。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，SR-AI敲除后MARCO受體(SR-A類受體家族的另一成員)表達(dá)量升高[15]，推測(cè)MARCO受體可能參與銅綠假單胞菌的吞噬，此假設(shè)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

SR-AI胞內(nèi)段缺乏信號(hào)修飾位點(diǎn)，本身并不直接激活炎癥信號(hào)通路，只能協(xié)同參與其他炎癥信號(hào)通路(如Toll樣信號(hào)通路)[2,15]。一些相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其能參與調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)[15-20]。有研究發(fā)現(xiàn)，SR-AI被激活后能抑制炎癥反應(yīng)[15,17,20]，但也有研究發(fā)現(xiàn)SR-AI被激活后能促進(jìn)炎癥反應(yīng)[16,18-19]。目前對(duì)SR-AI的作用尚存在爭(zhēng)議，其也因此被看作是一種多功能受體。

本研究發(fā)現(xiàn)SR-AI具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌刺激后，SR-AI-/-小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-12β的表達(dá)比野生型小鼠明顯升高，表明SR-AI可能具有抑制肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌引發(fā)炎癥反應(yīng)的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌感染動(dòng)物模型中，兩者感染能導(dǎo)致機(jī)體肺部炎癥因子升高[21-23]，而較高的炎癥因子表達(dá)量往往使器官損傷[24]。在肺部炎癥中，較高炎癥因子往往與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)[25-26]，特別是IL-1β表達(dá)與肺部損傷直接相關(guān)[27]。從這個(gè)意義上來(lái)說(shuō)，SR-AI在肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌感染過(guò)程中抑制炎癥因子表達(dá)可能是對(duì)機(jī)體的保護(hù)，能防止炎癥因子過(guò)量表達(dá)對(duì)肺部造成的損傷。

綜上所述，本研究表明SR-AI能參與巨噬細(xì)胞對(duì)肺炎克雷伯菌的吞噬，但不參與對(duì)銅綠假單胞菌的吞噬，同時(shí)可能具有抑制肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌引發(fā)炎癥反應(yīng)的功能，從而對(duì)肺部起保護(hù)作用。

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Role of scavenger receptor class A type I in regulating murine peritoneal macrophages againstKlebsiellapneumoniaeandPseudomonasaeruginosainfection

XIAO Haihan, FAN Xia, GUO Mingquan, LUO Tingting, XIA Bili, HE Ping

Department of Microbiology and Immunology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

The aim of this study is to investigate the immune regulation function of scavenger receptor class A type I (SR-AI) on macrophages for the treatment of two common pathogens of respiratory tract:Klebsiellapneumoniae(K.pneumoniae) andPseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa). The clinical isolates ofK.pneumoniaeandP.aeruginosawere collected. They were stained by fluorescent dyes and subjected to the peritoneal macrophages prepared from wide-type (WT) andSR-AI-/-mice respectively. The results showed thatSR-AI-/-macrophages had lower phagocytic ability toK.pneumoniae, but higher phagocytic ability toP.aeruginosathan WT macrophages. Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect mRNA expressions of inflammatory cytokines. The results showed that the inflammatory reactions ofSR-AI-/-macrophages were significantly improved than WT macrophages after infection ofK.pneumoniaeandP.aeruginosa. The data suggest that SR-AI could participate in the phagocytosis ofK.pneumoniaeby macrophages, but not in the phagocytosis ofP.aeruginosa. Besides, SR-AI plays a role in downregulation of inflammatory reactions induced by infection ofK.pneumoniaeandP.aeruginosa.

Murine macrophage; Scavenger receptor class A type I;Klebsiellapneumoniae;Pseudomonasaeruginosa; Phagocytosis; Inflammation

國(guó)家自然科學(xué)基金(81471908)

何平

Corresponding author. HE Ping, E-mail: hpatsh@sjtu.edu.cn

2016-04-22)