孫淑惠

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

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·論著·

Ki67與核酸熒光共染在細(xì)胞周期研究中的應(yīng)用

孫淑惠

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

病原微生物與宿主細(xì)胞的相互作用是感染過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，也是研究腫瘤生物學(xué)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。動(dòng)態(tài)研究細(xì)胞周期變化對(duì)了解病原體作用于細(xì)胞具有重要意義。本研究用Ki67/4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)和Ki67/碘化丙啶(propidium iodide，PI)共染技術(shù)分析了小鼠脾細(xì)胞的細(xì)胞周期變化，并介紹其具體應(yīng)用。

細(xì)胞周期；流式細(xì)胞術(shù)；Ki67；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；碘化丙啶

細(xì)胞周期是指具有分裂能力的細(xì)胞從準(zhǔn)備啟動(dòng)分裂到下一次分裂完成為止的過(guò)程。細(xì)胞周期研究是近年來(lái)生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。病原體在感染過(guò)程中，可作用于宿主細(xì)胞和機(jī)體免疫系統(tǒng)，引起機(jī)體細(xì)胞分裂增殖，即細(xì)胞周期發(fā)生變化，因此細(xì)胞周期檢測(cè)也是微生物與感染研究中的重要內(nèi)容[1-3]。

細(xì)胞的生命周期可分為G0、G1、S、G2和M期5個(gè)時(shí)相。細(xì)胞在進(jìn)入細(xì)胞周期后，各時(shí)相中DNA含量是變化的。在哺乳類動(dòng)物中，G0期細(xì)胞是不參與增殖周期循環(huán)的一群細(xì)胞，即為靜止期細(xì)胞，其細(xì)胞為恒定的二倍體DNA含量(2C)。G1期細(xì)胞已具有增殖活性，參與細(xì)胞周期循環(huán)，但DNA尚未進(jìn)入復(fù)制階段，因此其DNA含量亦為二倍體(2C)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期后，DNA開(kāi)始進(jìn)入復(fù)制階段，含量逐漸增加，從2C增至4C(四倍體)，直至細(xì)胞DNA倍增結(jié)束，進(jìn)入G2期，最終進(jìn)入M期。在M期分裂為2個(gè)子細(xì)胞之前，G2和M期的DNA含量均為恒定的4C。

由于病毒缺少細(xì)胞器，其必須借助宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白或細(xì)胞器來(lái)輔助病毒的蛋白合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及病毒包裝。因此，細(xì)胞周期的改變與調(diào)控，對(duì)病毒功能有巨大影響。一些小DNA病毒，如猴病毒40 (simian virus 40)[4]、腺病毒(adenovirus)[5]、人乳頭瘤病毒(human papillomavirus)[6]，由于自身缺少蛋白聚合酶，需依賴宿主細(xì)胞編碼某些蛋白以維持宿主細(xì)胞停留于S期，幫助病毒自身基因組合成。較大的DNA病毒(如皰疹病毒)有能力使感染的宿主細(xì)胞停留于G0/G1期，以避免與宿主細(xì)胞在自身DNA復(fù)制過(guò)程中競(jìng)爭(zhēng)原材料[7]。同樣，在反轉(zhuǎn)錄DNA病毒復(fù)制過(guò)程中，細(xì)胞周期受細(xì)胞核的精確調(diào)控。人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)感染細(xì)胞后，病毒Vpr蛋白可使細(xì)胞周期停留于G2/M期，從而有利于HIV-1復(fù)制[8]。盡管在RNA病毒感染過(guò)程中病毒復(fù)制主要在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行，但也有一些研究觀察到宿主的細(xì)胞周期改變對(duì)病毒功能有明顯影響。例如，在冠狀病毒家族中，傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)可使感染的宿主細(xì)胞發(fā)生周期變化，使其停留于G2/M期，從而有利于病毒復(fù)制[9]。而小鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)感染的細(xì)胞中，宿主細(xì)胞停留于G0/G1期，有助于病毒復(fù)制[10-11]。

鑒于DNA復(fù)制在細(xì)胞周期中的特點(diǎn)，DNA含量檢測(cè)成為提供細(xì)胞周期信息的最常用指標(biāo)。目前，國(guó)內(nèi)外廣泛使用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色法檢測(cè)DNA含量，從而進(jìn)行各類人及動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞周期研究[12-14]。其原理主要是利用PI與細(xì)胞內(nèi)DNA的結(jié)合，DNA含量越高，PI熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。這一方法可區(qū)分G0/G1期(2C DNA)、S期(2C～4C DNA)和G2/M期(4C DNA)細(xì)胞，但不能區(qū)分均為二倍體的G0與G1期細(xì)胞，因此并不能嚴(yán)格區(qū)分靜止期細(xì)胞與已進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞。

Ki67是一種在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的蛋白。雖然其確切的生物學(xué)作用目前尚不清楚，但其表達(dá)有個(gè)特點(diǎn)，即只有在進(jìn)入細(xì)胞周期(G1、S、G2和M)才表達(dá)，在G0期不表達(dá)或極低水平表達(dá)[15]。由于Ki67表達(dá)與細(xì)胞進(jìn)入周期有嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系，其被認(rèn)為是細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的一個(gè)理想標(biāo)記，因此廣泛應(yīng)用于鑒定細(xì)胞周期[16-18]。目前，大部分研究主要使用Ki67單染來(lái)表示細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，只能區(qū)分G0 期與已進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞，并不能區(qū)分已進(jìn)入細(xì)胞周期各時(shí)相(G1、S、G2和M)的細(xì)胞[19-20]。

PI單染和Ki67單染在鑒定細(xì)胞周期中均存在一定缺陷，因此有必要發(fā)展一種更有效的細(xì)胞周期染色方法?，F(xiàn)介紹一種新的利用Ki67與4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)或PI共染來(lái)鑒定細(xì)胞周期的方法。Ki67只在進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞中表達(dá)，因此能區(qū)分G0期細(xì)胞。DAPI和PI是與DNA有較強(qiáng)親和力的熒光染料，能區(qū)分DNA合成前(G0和G1，2C DNA)、合成時(shí)(S，2C～4C DNA)與合成后(G2和M，4C DNA)的細(xì)胞。因此，利用Ki67與DAPI或PI雙染，能區(qū)分G0(DAPI/PI低Ki67-)、G1(DAPI/PI低Ki67+)、S(DAPI/PI中Ki67+)和G2/M(DAPI/PI高Ki67+)期細(xì)胞。與傳統(tǒng)的PI單染相比，雙染能有效區(qū)分G0與G1期細(xì)胞?，F(xiàn)以小鼠脾臟細(xì)胞為例予以介紹。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞準(zhǔn)備

取小鼠脾臟B10.S細(xì)胞，經(jīng)紅細(xì)胞裂解后計(jì)數(shù)，將密度調(diào)至107個(gè)/mL，置于含5%小牛血清(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，備用。

1.2主要試劑與儀器

70%乙醇(分析純)、RNase A、PI和DAPI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-抗Ki67(clone：16A8)和FITC-同型(isotype)對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，F(xiàn)c阻斷劑(純化的抗小鼠CD16/32；clone：2.4G2)購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司 ，F(xiàn)oxp3核轉(zhuǎn)錄因子染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ebioscience公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD LSRFortessa公司。

1.3方法

1.3.1PI單染取2×106個(gè)脾細(xì)胞，加入2 mL冰預(yù)冷的70%乙醇，混勻，-20 ℃過(guò)夜；350g離心5 min，棄上清液；加入2 mL 1×PBS洗1次，350g離心5 min，棄上清液；加入0.5 mL PI染液〔50 μL RNase、 50 μL 1 mg/mL PI、20 μL 5% Triton-100、100 μL 0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)于1×PBS中，終體積為0.5 mL〕，4 ℃避光30 min。開(kāi)啟BD LSFortessa，啟用PE頻道，用于識(shí)別PI。PE頻道使用線性模式。調(diào)至合適電壓，讀取10 000個(gè)細(xì)胞后，停止讀數(shù)。

1.3.2Ki67/DAPI雙染和Ki67/PI雙染將2×106個(gè)脾細(xì)胞置于染色孔中(圓底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)，4 ℃離心，棄上清液。將100 μL抗小鼠CD16/32(1∶200，用含5%小牛血清的PBS稀釋)加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，混勻，置冰上孵育20 min；4 ℃離心，棄上清液；加入100 μL Foxp3試劑盒攜帶的細(xì)胞固定/穿孔液，混勻，避光，室溫(23 ℃)孵育1 h；加入100 μL Foxp3試劑盒攜帶的穿孔液，混勻后室溫離心，棄上清液；加入100 μL FITC-抗Ki67(稀釋液∶穿孔液為1∶100)或相同濃度的FITC-同型對(duì)照，混勻，避光，室溫孵育1 h；加入100 μL穿孔液，混勻后室溫離心，棄上清液；加入200 μL穿孔液，混勻后室溫離心，棄上清液；將細(xì)胞重懸于200 μL含5%小牛血清的PBS中，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞管；將100 μL DAPI(3 μg/mL，稀釋液為含5%小牛血清的PBS)或200 μL PI加入含已染色細(xì)胞的流式細(xì)胞管中，混勻，避光，冰上孵育10 min左右。開(kāi)啟BD LSRFortessa，啟用FITC、Pacific blue和PE 3個(gè)頻道，分別識(shí)別抗FITC-Ki67、DAPI和PI。其中FITC頻道使用log模式，Pacific blue和PE頻道使用線性模式。調(diào)至合適電壓，讀取20 000個(gè)細(xì)胞后，停止讀數(shù)。

2　結(jié)果

PI單染結(jié)果見(jiàn)圖1。X軸以線性PI熒光強(qiáng)度表示DNA含量，Y軸為相對(duì)細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，G0/G1期細(xì)胞占96.4%，S期細(xì)胞占1.8%，G2/M 期細(xì)胞占1.7%。G0期和G1期均為二倍體細(xì)胞，因此該法未能區(qū)分。

圖1PI單染進(jìn)行細(xì)胞周期鑒定

Fig.1Cell cycle identified by PI staining

Ki67和DAPI雙染見(jiàn)圖2。X軸以線性DAPI熒光強(qiáng)度表示DNA含量，Y軸以熒光強(qiáng)度表示Ki67表達(dá)量。以FITC同型抗體為參照[21]，結(jié)果顯示，G0期細(xì)胞占48.6%，G1期細(xì)胞占48.7%，S期細(xì)胞占1.4%，G2/M期細(xì)胞占1.0%。該法能有效區(qū)分G0與G1期細(xì)胞。Ki67和PI雙染見(jiàn)圖3。X軸以線性PI熒光強(qiáng)度表示DNA含量，Y軸以熒光強(qiáng)度表示Ki67表達(dá)量。結(jié)果顯示，G0期細(xì)胞占45.2%，G1期細(xì)胞占49.3%，S期細(xì)胞占1.5%，G2/M期細(xì)胞占1.2%。該法也能有效區(qū)分G0與G1期細(xì)胞。

以上結(jié)果顯示，利用PI單染和Ki67/DAPI或Ki67/PI雙染進(jìn)行細(xì)胞周期鑒定，結(jié)果具有較好的可比性。與傳統(tǒng)的PI單染相比，Ki67/DAPI或Ki67/PI雙染能有效區(qū)分G0與G1期細(xì)胞 。

圖2Ki67/DAPI雙染進(jìn)行細(xì)胞周期鑒定

Fig.2Cell cycle identified by Ki67 and DAPI co-staining

圖3Ki67/PI雙染進(jìn)行細(xì)胞周期鑒定

Fig.3Cell cycle identified by Ki67 and PI co-staining

3　討論

病毒的復(fù)制需從宿主細(xì)胞獲得必要的資源，這一過(guò)程可能與細(xì)胞周期中的某一時(shí)相有關(guān)。因此，病毒感染細(xì)胞后常通過(guò)改變細(xì)胞周期以有利于其復(fù)制。例如病毒通過(guò)感染不分裂的細(xì)胞誘導(dǎo)S期，激活細(xì)胞DNA復(fù)制，從而獲得病毒DNA復(fù)制所需的三磷酸脫氧核苷等。病毒還可通過(guò)破壞細(xì)胞周期蛋白及依賴細(xì)胞周期蛋白激酶復(fù)合物以影響細(xì)胞周期[22-23]。此外，病毒作用于細(xì)胞周期還與惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。因此，細(xì)胞周期檢測(cè)在研究感染性疾病與腫瘤中具有重要意義。如果宿主細(xì)胞在S期和G2/M期的存在時(shí)間相對(duì)較短或所占比例很少，僅依靠PI單染來(lái)鑒定細(xì)胞周期，可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，得出錯(cuò)誤結(jié)論。在這種情況下，如果使用Ki67/DAPI或Ki67/PI雙染，可提高檢測(cè)的靈敏度。

筆者在國(guó)內(nèi)長(zhǎng)期從事流式細(xì)胞檢測(cè)工作，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的細(xì)胞周期檢測(cè)僅使用PI單染，因此推薦Ki67/DAPI或Ki67/PI雙染作為細(xì)胞周期鑒定的優(yōu)先方法。

此外，在使用Ki67/DAPI和Ki67/PI雙染技術(shù)時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。①Pacific blue和PE頻道不要用log模式。因?yàn)槿绻鸇API或PI熒光強(qiáng)度采用log模式，會(huì)使S期區(qū)分不明顯(圖4)。②進(jìn)行Ki67/DAPI雙染時(shí)，不能同時(shí)采用V500和Amcyan等使用Amcyan通道的熒光抗體檢測(cè)目標(biāo)分子。Pacific blue與Amcyan的兩種熒光染料發(fā)生波有較大重疊。當(dāng)DAPI濃度達(dá)1 μg/mL時(shí)，會(huì)導(dǎo)致較多的DAPI熒光被Amcyan頻道檢測(cè)到，從而造成Amcyan很強(qiáng)的假陽(yáng)性，使標(biāo)記分子無(wú)法正確顯示。因此，使用Ki67/DAPI雙染鑒定細(xì)胞周期時(shí)，建議關(guān)閉Amcyan通道。③FITC可與嗜酸性粒細(xì)胞中的顆粒非特異性結(jié)合[24],因此FITC-抗Ki67不能用于檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞的周期檢測(cè)。

圖4Log模式下顯示DAPI或PI熒光強(qiáng)度時(shí)S期的顯示圖形

Fig.4The pattern of S phase with DAPI or PI fluorescence intensity displayed in log scale

雖然Ki67/DAPI和Ki67/PI雙染法優(yōu)點(diǎn)明顯，但試劑價(jià)格相對(duì)較高，且需一定的技術(shù)培訓(xùn)，有效利用共享平臺(tái)是解決這一問(wèn)題的方法。

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Application of Ki67 and nuclear acid fluorescent dye co-staining in analysis of cell cycle

SUN Shuhui

Department of Medical Microbiology and Parasitology, Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

The interaction between pathogenic microbes and host cells is crucial for studies on infections and tumor cell biology. The kinetic studies of cell cycle are of significance for understanding the mechanisms mediated by microbesversushost cells. In this paper, a novel method for cell cycle analysis in mouse splenic cells by Ki67 and 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) or propidium iodide (PI) co-staining is introduced.

Cell cycle; Flow cytometry; Ki67; 4′,6-Diamidino-2-phenylindole; Propidium iodide

孫淑惠

Corresponding author. SUN Shuhui, E-mail: sunshuhui@fudan.edu.cn

2016-04-25)