趙可慶，楊晨，吳旸，郭麗敏，劉華勇，吉建，陳小英，鄭春泉

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海市耳鼻咽喉科臨床重點(diǎn)學(xué)科，上海 200031； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海 200025； 3. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 4. 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200031； 5. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科，上海 200025

?

·論著·

5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)不同疾病來(lái)源的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的體外殺傷作用

趙可慶1,*，楊晨1，2,*，吳旸3，郭麗敏1，劉華勇3，吉建4，陳小英5，鄭春泉1

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海市耳鼻咽喉科臨床重點(diǎn)學(xué)科，上海 200031； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院耳鼻咽喉科，上海 200025； 3. 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 4. 復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200031； 5. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院皮膚科，上海 200025

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)利用光敏劑與光源反應(yīng)后產(chǎn)生的活性氧，破壞細(xì)菌組分，進(jìn)而致細(xì)菌死亡。其多靶位殺傷特性在治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)感染方面有應(yīng)用前景，但相關(guān)研究尚處于起步階段。本研究MRSA菌株取自燒傷、急性咽炎、鼻竇炎和肺炎4類臨床常見(jiàn)MRSA感染性疾病患者，使用5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，ALA)光敏劑、發(fā)光二極管光源，于體外檢測(cè)ALA介導(dǎo)的PDT(ALA-PDT)對(duì)MRSA菌株的殺傷作用。結(jié)果顯示，經(jīng)5 mmol/L ALA孵育1 h后，給予360 J/cm2強(qiáng)光〔(633±10)nm〕照射1 h，ALA-PDT對(duì)MRSA菌株具有1.80 log10cfu的有效殺傷作用。結(jié)果提示，在相同實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)下，ALA-PDT對(duì)上述4種疾病來(lái)源的MRSA菌株體外殺傷作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

光動(dòng)力療法；5-氨基酮戊酸；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)是一類對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素普遍耐藥，具有較強(qiáng)毒性和較大危害性的金黃色葡萄球菌。自20世紀(jì)60年代在英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)至今，MRSA感染幾乎遍及全球。目前，臨床上治療MRSA感染主要用萬(wàn)古霉素、喹寧始霉素、利奈唑胺等藥物，但這類藥物的長(zhǎng)期使用會(huì)促使新的耐藥菌株出現(xiàn)[1-2]，因此相關(guān)感染的臨床治療工作面臨著巨大挑戰(zhàn)，對(duì)新治療手段的探索也成為亟待解決的問(wèn)題[3]。

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種使用特定波長(zhǎng)的可見(jiàn)光照射經(jīng)光敏劑預(yù)處理的靶細(xì)胞從而產(chǎn)生活性氧，破壞靶細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分，進(jìn)而致其死亡的治療手段[4]。由于活性氧分子的氧化性極高，這一特性使PDT在殺傷細(xì)菌時(shí)沒(méi)有特定的靶目標(biāo)[5]，不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥。PDT的這一作用機(jī)制從根本上克服了抗生素治療感染性疾病的諸多缺陷，理論上使其成為傳統(tǒng)抗生素治療方法的一種有效補(bǔ)充，以及在抗生素治療無(wú)效情況下的一種潛在替代性治療手段。

目前，PDT對(duì)MRSA殺傷效果的研究尚處于起步階段。本研究驗(yàn)證了5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，ALA)介導(dǎo)的PDT(ALA-PDT)對(duì)燒傷、急性咽炎、鼻竇炎和肺炎4種疾病來(lái)源的MRSA具有普遍殺傷作用，各組之間殺傷效率無(wú)差異，于體外初步探討了ALA-PDT用于治療MRSA感染的可行性，以期為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

本研究所用MRSA菌株取自南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院及復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院患者。ALA購(gòu)自上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司。光動(dòng)力治療儀〔發(fā)光二極管-IB(light emitting diode-IB，LED-IB)〕購(gòu)自武漢亞格光電技術(shù)有限公司。各種培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌取材及耐藥性監(jiān)測(cè)所有細(xì)菌均于無(wú)菌環(huán)境中取材，立即送至檢驗(yàn)科進(jìn)行菌種鑒定及藥敏測(cè)試，再將獲得的菌株保存于含有35%丙三醇的胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soya broth, TSB)培養(yǎng)基中，-80 ℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，于室溫下融化后劃線種菌。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng)取-80 ℃保存的菌種，按分區(qū)劃線法接種于胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soya agar，TSA)平板上，37 ℃靜態(tài)培養(yǎng)24 h。挑取4區(qū)單菌落接種于5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，按1∶200比例將菌液再次接種于5 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。將活化后的細(xì)菌懸液離心去上清液，收集底部細(xì)菌，加入無(wú)菌生理鹽水，調(diào)整細(xì)菌密度至2.0×108cfu/mL左右備用。

1.2.3ALA溶液的配制在避光條件下用無(wú)菌生理鹽水配制不同濃度的ALA溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后4 ℃避光保存。

1.2.4PDT參數(shù)光輸出波長(zhǎng)：(633±10)nm；光輸出功率密度：100 mW/cm2。60 min光照強(qiáng)度為360 J/cm2。

1.2.5PDT照射細(xì)菌于生物安全柜中，將菌液按100 μL/孔加入無(wú)菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每株細(xì)菌重復(fù)3孔。隨后每孔中加入ALA溶液，使ALA濃度達(dá)到相應(yīng)實(shí)驗(yàn)濃度，充分混勻，加蓋后外包錫紙，37 ℃振蕩孵育。取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于生物安全柜中，在上方約10 cm處安置光動(dòng)力儀照射燈頭，按360 J/cm2光照劑量予以紅光照射，照射光斑覆蓋整塊96孔板。以上實(shí)驗(yàn)均在避光條件下完成。

1.2.6細(xì)菌存活實(shí)驗(yàn)將ALA-PDT處理后的菌液離心，去上清液后收集底部細(xì)菌，用200 μL無(wú)菌生理鹽水重懸細(xì)菌。將樣本倍比稀釋后涂布于TSA平板，cfu計(jì)數(shù)，并將測(cè)得的cfu進(jìn)行以10為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換(log10cfu)，計(jì)算各組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。log10cfu結(jié)果用mean±SD表示。兩組間均值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1單純光敏劑或光照射影響細(xì)菌活性相關(guān)參數(shù)的優(yōu)化

分別取燒傷患者皮膚分泌物、急性咽炎患者口咽部分泌物、鼻竇炎患者中鼻道分泌物及肺炎患者痰液，經(jīng)藥敏試驗(yàn)后共篩選26株MRSA，其中燒傷組6株、急性咽炎組7株、鼻竇炎組 7株、肺炎組6株(表1)。

表1臨床MRSA菌株耐藥情況

Tab.1Drug sensitivity testing of MRSA strains

SampleresourcenResistanceMethi-cillinClin-damycinErythro-mycinGenta-mycinNorflox-acinPeni-cillinRifam-picinTetra-cyclineCom-poundsulfame-thoxazoleBurn6100%100%100%100%67%100%50%100%33%Acutepharyngitis7100%71%71%57%71%100%57%57%0%Nasosinusitis7100%71%57%100%71%100%57%71%57%Pneumonia6100%83%83%100%100%100%83%100%67%Mean100%81%78%89%77%100%62%82%39%

結(jié)合現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[6]設(shè)計(jì)參數(shù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。以MRSA USA300菌株為模式菌，使用不同濃度(0、1.25、2.5、5、10 mmol/L)的光敏劑對(duì)細(xì)菌進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)(1或2 h)的孵育處理，并對(duì)孵育后的細(xì)菌進(jìn)行cfu計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，經(jīng)1 h處理后，10 mmol/L ALA組的log10cfu值與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而2 h處理后，5 mmol/L ALA即可對(duì)細(xì)菌活性產(chǎn)生影響(P<0.05)(圖1A)。

使用不同光照強(qiáng)度(0、60、120、240、360 J/cm2)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行照射，結(jié)果顯示不同強(qiáng)度光照組細(xì)菌活性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖1B)。

在此基礎(chǔ)上測(cè)定不同濃度ALA與不同強(qiáng)度光照組合對(duì)細(xì)菌的殺傷作用。結(jié)果顯示，當(dāng)ALA濃度為5 mmol/L、 光照強(qiáng)度為360 J/cm2時(shí)，細(xì)菌的

殺傷效果最明顯(圖2)。綜合參考有效性和安全性后，設(shè)定5 mmol/L ALA孵育細(xì)菌1 h后，給予360 J/cm2強(qiáng)度光照作為PDT參數(shù)。

2.2PDT對(duì)臨床MRSA菌株活性影響的檢測(cè)

ALA-PDT對(duì)臨床MRSA菌株具有殺傷作用(對(duì)照組log10cfu=8.28±0.05，n=26；實(shí)驗(yàn)組log10cfu=6.48±0.16，n=26；P<0.01)(圖3A)，其殺傷效率(log10cfu對(duì)照組- log10cfu實(shí)驗(yàn)組)分布于0.46～3.68(圖3B)。 按不同疾病對(duì)殺傷效率進(jìn)行分組統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示PDT對(duì)各組標(biāo)本的殺傷效率分別為：燒傷組1.68±0.15(n=6)、急性咽炎組1.91±0.41(n=7)、鼻竇炎組1.86±0.32(n=7)，肺炎組1.77±0.38(n=6)，各組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖4)。

A: The effect of ALA with a range of concentration on bacterial cfu. B: Bacterial cfu after exposure to different LED intensities.

圖1單純光敏劑或光照對(duì)細(xì)菌活性的影響

Fig.1The influence of ALA or LED alone on bacterial cfu

圖2ALA-PDT對(duì)USA300模式菌株活性的影響
Fig.2The effect of ALA-PDT on USA300 with the combination of different ALA concentrations and LED densities

A: The viability of MRSA in ALA-PDT group and control group. B: The effect of ALA-PDT on each clinical MRSA strain from burn, acute pharyngitis, nasosinusitis and pneumonia.

圖3ALA-PDT對(duì)臨床MRSA菌株活性的影響

Fig.3The effects of ALA-PDT on different clinical MRSA strains

圖4ALA-PDT對(duì)不同疾病來(lái)源MRSA菌株的殺傷效果

Fig.4The effects of ALA-PDT on different clinical MRSA strains

3　討論

MRSA是醫(yī)院內(nèi)和社區(qū)感染[7]的重要致病菌之一，其毒性強(qiáng)、危害大，對(duì)一些免疫缺陷患者甚至是致命的。目前，抗生素仍是臨床治療MRSA感染的主要手段，但由于其殺傷細(xì)菌的靶位較為單一，長(zhǎng)期使用會(huì)促使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。已有文獻(xiàn)報(bào)道MRSA菌株對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥[8]。此外，MRSA常具有多重耐藥性[9]，致使相關(guān)感染的治療過(guò)程復(fù)雜且效果受限，成為臨床研究中亟待攻克的難題。PDT能利用光敏劑與光源反應(yīng)后產(chǎn)生的活性氧，破壞核酸、蛋白質(zhì)、膜脂質(zhì)等細(xì)菌組分而致細(xì)菌死亡[10]。這一光敏作用所表現(xiàn)出的多靶位殺傷特性使MRSA不易對(duì)PDT產(chǎn)生耐藥性，在相關(guān)感染的治療中較抗生素更有優(yōu)勢(shì)，極具潛在的應(yīng)用價(jià)值[11]。據(jù)此，本研究選取ALA作光敏劑、LED作光源，自燒傷、急性咽炎、鼻竇炎和肺炎4類臨床常見(jiàn)MRSA感染性疾病患者收集MRSA菌株，在相同實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)下，證實(shí)ALA-PDT對(duì)上述4類疾病來(lái)源的MRSA菌株體外殺傷效果明顯，且各組間殺傷效果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

目前，關(guān)于ALA-PDT在治療MRSA感染及其相關(guān)領(lǐng)域的研究尚處于起步階段。Grinholc曾報(bào)道，MRSA菌株與10 mmol/L ALA 孵育24 h，經(jīng)(624±18)nm波長(zhǎng)、50 J/cm2強(qiáng)度的光照射后，于體外能被有效殺傷(log10cfu下降1.6)[3]。但由于該結(jié)論僅基于對(duì)1株MRSA菌株的研究，數(shù)量過(guò)少，其結(jié)論的可靠性存疑。此外，在Grinholc實(shí)驗(yàn)中ALA孵育MRSA菌株的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24 h，后續(xù)的光照射時(shí)間也有4 h 10 min。如此長(zhǎng)的處理時(shí)間，從臨床應(yīng)用角度考慮，缺乏可行性。對(duì)比上述研究，同時(shí)參考Nitzan等的研究結(jié)果——金黃色葡萄球菌經(jīng)0.38 mmol/L ALA孵育4 h，即可于細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生大量光敏劑原卟啉Ⅸ (protoporphyrin Ⅸ，PpⅨ)[6]，本研究從4種臨床常見(jiàn)的MRSA感染性疾病患者中選取26株MRSA，經(jīng)5 mmol/L ALA孵育1 h后，給予360 J/cm2強(qiáng)度LED光〔(633±10)nm〕照射1 h，結(jié)果顯示在該參數(shù)條件下，ALA-PDT對(duì)MRSA菌株具有1.80 log10cfu的有效殺傷作用。據(jù)此，本研究樣本種類具有臨床代表性，且數(shù)量充足，選取的實(shí)驗(yàn)參數(shù)又考慮到了后續(xù)臨床應(yīng)用，為研究的深入開(kāi)展奠定了良好基礎(chǔ)。

在相同的實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)下，本研究對(duì)4種不同疾病來(lái)源的MRSA菌株進(jìn)行分組，比較ALA-PDT體外殺傷作用，結(jié)果顯示殺傷效率無(wú)差異。此類實(shí)驗(yàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。該結(jié)果表明，MRSA菌株來(lái)源的不同不是決定ALA-PDT對(duì)MRSA菌株體外殺傷作用有效性的關(guān)鍵因素。由此推斷，雖然MRSA感染導(dǎo)致的各類疾病有不同的臨床特征，但ALA-PDT對(duì)其的殺傷作用極有可能是普遍存在的。

本研究選擇ALA作為光敏劑是因?yàn)槠渲辉诩?xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為PpⅨ[12]，而細(xì)菌比正常人體細(xì)胞的代謝速度快，所以ALA-PDT的光敏作用更集中表現(xiàn)在細(xì)菌而非周圍組織細(xì)胞，這一特性使其較其他光敏劑介導(dǎo)的PDT在臨床應(yīng)用中有更高的安全性。目前已證實(shí)，ALA作為第2代卟啉類光敏劑，其本身不具備光敏活性，而是作為亞鐵血紅素代謝途徑的第一級(jí)產(chǎn)物天然存在于細(xì)菌和真核細(xì)胞中并產(chǎn)生PpⅨ，當(dāng)PpⅨ積累到一定濃度后，經(jīng)585～635 nm波長(zhǎng)光處理即可發(fā)生光敏效應(yīng)而殺傷細(xì)菌[13]。本研究通過(guò)控制外源性ALA的加入量和孵育時(shí)間，以及LED功率和光照時(shí)間影響光敏作用的效果，在參考相關(guān)文獻(xiàn)并綜合考慮臨床因素后，確定實(shí)驗(yàn)參數(shù)。結(jié)果證實(shí)，MRSA菌株在與5 mmol/L ALA孵育1 h，經(jīng)(633±10)nm波長(zhǎng)、360 J/cm2光照強(qiáng)度的LED光源照射1 h后，殺傷作用有效。

需特別指出的是，本研究中不同MRSA菌株對(duì)ALA-PDT殺傷作用的敏感性呈現(xiàn)出了菌株依賴性。經(jīng)ALA-PDT處理后，MRSA菌株的log10cfu下降范圍介于0.46～3.68，ALA-PDT對(duì)不同菌株的殺傷作用存在很大差異。類似現(xiàn)象在Grinholc等應(yīng)用PPArg2作為光敏劑的研究中亦有報(bào)道[14]。目前研究認(rèn)為，這一現(xiàn)象可能與細(xì)菌自身的藥物泵系統(tǒng)、生物膜形成能力、細(xì)菌毒力等因素有關(guān)，但確切機(jī)制仍有待深入研究[15]。

目前，臨床應(yīng)用PDT治療感染性疾病僅限于口腔科和皮膚科。影響PDT廣泛應(yīng)用的主要原因包括：①PDT產(chǎn)生光敏作用所需的照射光源穿透能力有限，故其適用范圍被限制在體表或體腔感染性疾病，對(duì)深部感染的治療存在照射和給藥困難的問(wèn)題[16]。②PDT對(duì)不同組織的作用安全性仍需大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。③對(duì)于鼻腔這種存在大量正常菌群的部位，PDT的應(yīng)用有導(dǎo)致菌群失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)。隨著PDT與納米技術(shù)和分子靶向技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的不斷開(kāi)展[17]，以及光敏劑和光源的不斷優(yōu)化，相信這些問(wèn)題將得以逐步解決，PDT治療感染性疾病的潛力不可限量。

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Invitrostudy of antimicrobial effect of photodynamic therapy using 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic treatment against methicillin-resistantStaphylococcusaureusstrains from different infectious diseases

ZHAO Keqing1,*, YANG Chen1,2,*, WU Yang3, GUO Limin1, LIU Huayong3, JI Jian4, CHEN Xiaoying5, ZHENG Chunquan1

1. Department of Otolaryngology, Eye, Ear, Nose and Throat Hospital, Fudan University; Shanghai Key Clinical Disciplines of Otorhinolaryngology, Shanghai 200031, China; 2. Department of Otolaryngology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China; 3. Department of Medical Microbiology and Parasitology, Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China; 4. Department of Clinical Laboratory, Eye, Ear, Nose and Throat Hospital, Fudan University, Shanghai 200031, China; 5. Department of Dermatology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200025, China

In photodynamic therapy (PDT), the reactive oxygen species generated by the activation of photosensitizers by light of an appropriate wavelength, are able to inactivate microbes by damaging various microbial components. Due to its multi-targeting antimicrobial capability, PDT has shown a potential as an effective alternative therapeutic option against methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA). In this study, MRSA strains isolated from burn, acute pharyngitis, nasosinusitis and pneumonia patients were subjected to a 5-aminolevulinic acid (ALA) mediated light emitting diode (LED) arrayinvitro. The results showed that a significant reduction (1.8 log10cfu) was achieved with an ALA treatment (1 h, 5 mmol/L) followed by 1 h of illumination [(633±10) nm wavelength light source, and a 360 J/cm2light dose]. MRSA strains collected from different tissues showed a similar sensitivity to the treatment.

Photodynamic therapy; 5-Aminolevulinic acid; Methicillin-resistantStaphylococcusaureus

國(guó)家自然科學(xué)基金(81300810)，上海市青年醫(yī)師培養(yǎng)資助計(jì)劃(20141057)

鄭春泉，趙可慶

Corresponding authors. ZHENG Chunquan, E-mail: 96zheng@sina.com; ZHAO Keqing, E-mail: rhinoresearch@163.com

2015-11-23)

*同為第一作者