王 星，趙 樺，馬英麗，楊秋琛，陳曉玲（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000）

響應(yīng)面法優(yōu)化盤龍七中巖白菜素的提取工藝

王 星，趙 樺*，馬英麗，楊秋琛，陳曉玲
（陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723000）

為優(yōu)化盤龍七藥材中巖白菜素的超聲提取工藝，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析方法建立了盤龍七巖白菜素的超聲提取功率、超聲提取時間、乙醇濃度和提取溫度的二次響應(yīng)曲面方程。結(jié)果表明，對盤龍七巖白菜素提取率影響的大小次序?yàn)椋撼曁崛囟?、超聲功率、乙醇濃度和超聲提取時間。盤龍七巖白菜素超聲提取工藝的最佳條件為：提取溫度為59℃、超聲功率270 W、乙醇濃度75%，提取時間40 min/次，料液比1∶30，提取3次，在此條件下盤龍七巖白菜素得率為6.429%，與模型預(yù)測值6.432%高度相符。

盤龍七，巖白菜素，超聲提取，響應(yīng)面分析法

盤龍七（Rhizoma Bergeniae Scopulosae），為虎耳草科（Saxifragaceae）巖白菜屬植物秦嶺巖白菜（Bergenia scopulosa T P Wang）的根莖，多年生草本，分布于陜西秦嶺西段及甘肅東南部，生于海拔2500～3600 m的林下陰濕處或峭壁石隙，為我國特有種［1-2］。盤龍七是陜西民間常用藥，有補(bǔ)脾健胃，收澀固腸，除濕利水，活血之功效。臨床上用于治療急慢性腸胃炎、浮腫、崩漏、白帶、淋癥、痢疾、黃水瘡、禿瘡、疥癬等［3］。研究報道，盤龍七含有較為豐富的巖白菜素（Bergenin），現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，巖白菜素具有良好的鎮(zhèn)咳和治療胃腸道疾病的功效，如胃潰瘍、腹瀉及便秘，此外還具有良好的抗炎、抗心律失常、抗病毒、護(hù)肝等作用［4-6］。

超聲提取法近年來已廣泛用于天然產(chǎn)物中有效成分的提取，該方法也有用于植物中巖白菜素提取的研究報道［7-11］。響應(yīng)面分析法（Response surface analysis，RSA）是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，以回歸分析尋求最優(yōu)工藝的有效方法，已廣泛應(yīng)用在中藥有效成分提取工藝等諸多工藝過程優(yōu)化控制等領(lǐng)域［12-16］，但使用響應(yīng)面法優(yōu)化盤龍七藥材中巖白菜素提取工藝的研究尚未見報道。本文以甘肅省隴南市文縣產(chǎn)盤龍七為原材料，采用超聲波輔助提取法，通過單因素實(shí)驗(yàn)，分析比較提取分離過程中各因素對巖白菜素提取的影響，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化其巖白菜素提取工藝。研究結(jié)果將豐富對盤龍七藥材的應(yīng)用研究的積累，同時也為巖白菜屬植物資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

盤龍七 產(chǎn)自甘肅省隴南市文縣，經(jīng)漢中藥檢所彭強(qiáng)主任藥師鑒定為秦嶺巖白菜干燥根莖，即盤龍七藥材；巖白菜素對照品 購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；乙腈 色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；乙醇、磷酸 分析純，西安化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；水 為自制超純水。

Waters e2695高效液相色譜儀、Empower色譜工作站 美國Waters公司；U-3900H紫外分光光度計(jì)日本日立公司；AB204-S電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司，UPH-II-10T優(yōu)普超純水機(jī) 成都優(yōu)普凈化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 盤龍七中巖白菜素的提取 取盤龍七藥材→在60℃條件下烘干→粉碎過60目篩→稱取約1.0 g，精密稱定→超聲輔助提取→濾過→定容→放于4℃冰箱中備用。

1.2.2 巖白菜素含量的測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密稱取巖白菜素對照品7.5 mg，用甲醇定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成75 μg/mL（母液）的對照品溶液。準(zhǔn)確量取巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品母液2、4、6、8 mL，分別用無水甲醇定容至10 mL的棕色容量瓶中，配制成濃度分別為15、30、45、60 μg/mL的巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加上巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品母液共五種不同濃度的溶液分別進(jìn)樣，每個濃度分別進(jìn)樣三次，每次進(jìn)樣10 μL，進(jìn)樣前用0.45 μm的濾膜過濾，測定峰面積，以巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 樣品測定 HPLC法分析盤龍七中巖白菜素的色譜條件為：色譜柱為Inertsil ODS-3C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液（9∶91）為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm，柱溫30℃。按1.2.2.1的方法測定樣品供試液，根據(jù)巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)曲線，按下式計(jì)算樣品中巖白菜素得率：

式中，C代表供試品溶液的濃度（g/mL），V代表供試品溶液的總體積（mL），M代表所稱取盤龍七藥材的量（g）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以巖白菜素得率為考察指標(biāo)進(jìn)行評價和分析，分別考察超聲提取功率、料液比、提取溶劑乙醇濃度、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間6個因素對盤龍七中巖白菜素提取得率的影響，篩選其中4個對巖白菜素得率影響較大的因素，確定其最佳參數(shù)作為響應(yīng)面分析因素。

1.2.3.1 超聲功率對巖白菜素得率的影響 以1∶30為料液比，60%的乙醇為溶劑，在50℃的條件下，分別將功率設(shè)為180、210、240、270和300 W五個梯度，超聲提取三次，每次30 min，按1.2.1方法測定得率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3.2 料液比對巖白菜素得率的影響 以240 W做為超聲提取功率，以60%的乙醇為溶劑，在50℃條件下，分別將料液比設(shè)置為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40五個梯度，超聲提取三次，每次30 min，按1.2.1方法測定得率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3.3 乙醇濃度對巖白菜素得率的影響 以240 W做為超聲提取功率，料液比為1∶30，在50℃條件下，分別將乙醇濃度設(shè)置為50%、60%、70%、80%和90%五個梯度，超聲提取三次，每次30 min，按1.2.1方法測定得率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3.4 提取溫度對巖白菜素得率的影響 以240 W做為超聲提取功率，料液比為1∶30，以60%的乙醇為溶劑，分別將提取溫度設(shè)置為40、50、60、70和80℃五個梯度，超聲提取三次，每次30 min，按1.2.1方法測定得率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3.5 提取次數(shù)對巖白菜素得率的影響 以240 W做為超聲提取功率，料液比為1∶30，以60%的乙醇為溶劑，分別將提取次數(shù)設(shè)為1次、2次、3次和4次四個梯度，在50℃條件下，超聲提取三次，每次30 min，按1.2.1方法測定得率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3.6 提取時間對巖白菜素得率的影響 以240 W做為超聲提取功率，料液比為1∶30，以60%的乙醇為溶劑，分別將時間設(shè)為20、30、40、50和60 min五個梯度，在50℃條件下，超聲提取三次，按1.2.1方法測定得率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定超聲提取次數(shù)為3次，料液比為1∶30，采用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken的中心組合原理選取超聲功率（A）、提取時間（B）、乙醇濃度（C）、提取溫度（D）共4個對巖白菜素提取影響顯著的因素，以盤龍七巖白菜素得率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table1 Variables and levels in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design expert 8.0.6及Excel程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按1.2.2項(xiàng)下方法，得巖白菜素的回歸方程為：Y= 14942X-428.60（R2=0.9998），表明在15.0～75.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2，供試品色譜圖見圖3。

圖1 巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of bergenin

圖2 巖白菜素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Standard chromatogram of bergenin

圖3 巖白菜素供試品色譜圖Fig.3 Test sample chromatogram of bergenin

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 超聲功率對巖白菜素得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of bergenin

2.2.1 超聲功率對巖白菜素得率的影響 由圖4可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著超聲功率的增加，巖白菜素的得率呈上升趨勢，當(dāng)達(dá)到240 W時，得率達(dá)到最大值。從240～270 W趨勢變得平緩，當(dāng)再增大功率（270～300 W）后，巖白菜素得率又逐漸減小，這可能是由于隨著超聲功率的增加部分巖白菜素結(jié)構(gòu)遭到破壞所致。

2.2.2 料液比對巖白菜素得率的影響 由圖5可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著料液比的增大（1∶20～1∶30），得率呈上升趨勢，當(dāng)料液比繼續(xù)增大時（1∶30～1∶40），隨著料液比的增大，巖白菜素得率上升趨勢變得平緩，表明料液比大約為1∶30時，藥材中的巖白菜素絕大部分已被提取出，增大料液比雖能充分提取巖白菜素，但考慮提取成本，確定料液比為1∶30。

圖5 料液比對巖白菜素得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on yield of bergenin

2.2.3 乙醇濃度對巖白菜素得率的影響 由圖6可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著乙醇濃度的增大（50%～70%），巖白菜素得率呈不斷上升趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到約70%左右時巖白菜素得率達(dá)到最大值，隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大巖白菜素得率呈下降趨勢，表明巖白菜素在乙醇濃度大約為70%時，溶解度達(dá)到最大。

圖6 乙醇濃度對巖白菜素得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on yield of bergenin

2.2.4 提取溫度對巖白菜素得率的影響 由圖7可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著提取溫度的升高（40～60℃），巖白菜素得率呈上升趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到60℃左右時，巖白菜素得率達(dá)到最大，隨著溫度的繼續(xù)升高（60～80℃），巖白菜素得率呈不斷下降趨勢，此現(xiàn)象說明提取巖白菜素的最適溫度大約為60℃。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是隨著溫度的繼續(xù)升高（60～80℃），提取液中部分巖白菜素分解所致。

2.2.5 提取次數(shù)對巖白菜素得率的影響 由圖8可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著提取次數(shù)的增加（1～3次），巖白菜素得率呈不斷上升趨勢，隨著提取次數(shù)的再次增加（3～4次），巖白菜素得率基本呈平緩趨勢，此現(xiàn)象表明，提取3次和提取4次所得到的結(jié)果基本相同，考慮到生產(chǎn)實(shí)際，選取提取3次為宜，以節(jié)省提取溶劑和時間。

圖7 提取溫度對巖白菜素得率的影響Fig.7 Effect of extraction temperature on yield of bergenin

圖8 提取次數(shù)對巖白菜素得率的影響Fig.8 Effect of the number of repeated extraction on yield of bergenin

2.2.6 提取時間對巖白菜素得率的影響 由圖9可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著提取時間的增加（20～40 min），巖白菜素得率呈不斷上升趨勢，當(dāng)提取時間大約為40 min時，巖白菜素得率達(dá)到最大值，隨著提取時間的再增加（40～60 min），巖白菜素得率呈不斷下降趨勢，這可能是因?yàn)殡S著提取時間的再增加（40～60 min），進(jìn)入到提取劑中的巖白菜素由于過長時間的超聲振蕩和加熱等原因而導(dǎo)致部分巖白菜素被分解。

圖9 提取時間對巖白菜素得率的影響Fig.9 Effect of extraction time on yield of bergenin

在以上單因素實(shí)驗(yàn)考察的6個因素中，超聲功率、提取溫度、乙醇濃度和提取時間4個因素對巖白菜素得率的影響較明顯，隨著超聲功率增加、溫度提高、乙醇濃度加大和提取時間延長，都會使巖白菜素的得率由小到大，達(dá)到最大值后，又再減小。而料液比和提取次數(shù)2個因素對巖白菜素得率的影響不同，隨液料比和提取次數(shù)增加，巖白菜素得率由小到大，達(dá)到最大后，再增加液料比和提取次數(shù)時其得率基本保持穩(wěn)定，不會明顯降低。因此，在做本響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時，選擇對巖白菜素得率影響明顯的4個因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，而料液比和提取次數(shù)則選擇最佳條件為基本因素。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

2.3.1 二次回歸模型擬合及方差分析 利用軟件Design Expert 8.0.6的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，對超聲功率、提取時間、乙醇濃度、提取溫度進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到超聲提取功率（A），超聲提取時間（B），乙醇濃度（C），超聲提取溫度（D）的二次多項(xiàng)式回歸方程：

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析表Table3 ANOVA（analysis of variance）of tems of regression equation

從表3可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值的關(guān)系時，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（r=模型平方和/總離差平方和=0.9787），模型的顯著水平p＜0.0001，說明此模型高度顯著，與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，該實(shí)驗(yàn)方法可靠?；貧w方程各項(xiàng)方差分析，當(dāng)顯著水平小于0.05時，它所對應(yīng)的條件對響應(yīng)值的作用是顯著的，方程的失擬誤差不顯著，可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，A、B、C、D、AB、AC、AD、CD、A2、B2、C2、D2對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著。因此，各實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是線性關(guān)系。對盤龍七巖白菜素得率影響的大小依次為提取溫度＞超聲功率＞乙醇濃度＞提取時間，即超聲提取溫度對巖白菜素得率的影響最為顯著。

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 通過響應(yīng)面二次多項(xiàng)模型方程的建立，得到回歸優(yōu)化響應(yīng)面曲面圖，如圖10～圖13所示。

由圖10可知，超聲功率與乙醇濃度交互作用的響應(yīng)曲面陡峭，表明兩者對巖白菜素得率的影響非常顯著。當(dāng)提取功率較小，乙醇濃度較低時，得率較低。之后隨著超聲提取功率和提取溫度的提高，得率也隨之提高。在超聲功率達(dá)到240 W，乙醇濃度到達(dá)70%時，響應(yīng)值應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)，即得率最高。

圖10 超聲功率和乙醇濃度對巖白菜素得率的影響Fig.1 0 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and ethanol concentration on yield of bergenin

圖11 超聲功率和提取溫度對巖白菜素得率的影響Fig.1 1 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and extraction temperature on yield of bergenin

由圖11可知，超聲功率與提取溫度交互作用的響應(yīng)曲面陡峭，表明兩者對巖白菜素得率的影響非常顯著。當(dāng)提取功率較小，提取溫度較低時，得率較低。之后隨著超聲提取功率和提取溫度的提高，得率也隨之提高。在超聲功率達(dá)到240 W，提取溫度到達(dá)60℃時，響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)，即得率最高。

由圖12可知，提取溫度和乙醇濃度交互作用的響應(yīng)曲面較為陡峭，等高線圖表明兩者的交互作用影響比較顯著，特別是提取溫度的變化對巖白菜素得率的影響明顯，隨著溫度的升高，得率增加比較明顯。相比之下，乙醇濃度對得率的影響較小。

圖12 乙醇濃度和提取溫度對巖白菜素得率的影響Fig.1 2 Response surface plot showing the effects of ethanol concentration and extraction temperature on yield of bergenin

由圖13可知，超聲功率與提取時間交互作用的響應(yīng)曲面比較陡峭，表明兩者對巖白菜素得率的影響也比較顯著。隨著超聲功率的提高和提取時間的延長，巖白菜素的得率先緩慢提高，當(dāng)達(dá)到最大值后開始緩慢降低，說明超聲功率與提取時間的變化對巖白菜素得率有一定的影響。

圖13 超聲功率和提取時間對巖白菜素得率的影響Fig.1 3 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and extraction time onyield of bergenin

2.3.3 模擬驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果以及二次多項(xiàng)回歸方程，并利用Design expert 8.0.6軟件，得本實(shí)驗(yàn)回歸模型預(yù)測的盤龍七巖白菜素提取最佳工藝條件為：超聲功率270 W、乙醇濃度77.69%、提取時間40.37 min、提取溫度58.63℃。在此條件下盤龍七巖白菜素得率可達(dá)6.432%?？紤]到實(shí)際操作，將最佳工藝修正為超聲功率270 W、乙醇濃度75%，每次40 min、提取溫度59℃，在此條件下稱取盤龍七干燥粉末3份，進(jìn)行三組驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，巖白菜素的得率分別為6.431%、6.428%和6.429%，平均得率為6.429%（RSD=0.024%），與模型預(yù)測值高度相符。

3 結(jié)論

各因素對盤龍七巖白菜素得率影響的大小依次為提取溫度、超聲功率、乙醇濃度和提取時間，即超聲提取溫度對盤龍七巖白菜素得率的影響最為顯著。通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到盤龍七巖白菜素的超聲輔助提取最優(yōu)工藝條件為提取溫度為59℃、超聲功率270 W、乙醇濃度75%、提取時間40 min、料液比1∶30、提取3次，在此條件下盤龍七巖白菜素得率為6.429%。本研究結(jié)果為盤龍七中巖白菜素的研究及巖白菜素屬植物的開發(fā)與利用提供了一定的參考。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of bergenin from Rhizoma Bergeniae Scopulosae by response surface analysis

WANG Xing，ZHAO Hua*，MA Ying-li，YANG Qiu-chen，CHEN Xiao-ling
（College of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China）

In order to optimize the conditions of ultrasonic-assisted extraction method of bergenin from Rhizoma Bergeniae Scopulosae，on the base of single-factor experiment，an equation for the ultrasonic wave extraction was built.The experiment showed that ultrasonic extraction power，extraction time，ethanol concentration and extraction temperature had different effects on the extraction yield of bergenin.The result indicated that within tested level ranges，the importance of four process parameters affecting extraction yield of bergenin order were ultrasonic extraction temperature，ultrasonic power，ethanol concentration and ultrasonic extraction time.The optimum extraction conditions of bergenin were obtained as follows:the extraction temperature 59℃，extraction ultrasonic power 270 W，ethanol concentration 75%，extraction time of 40 minutes，the solid-liguid ratio was 1∶30，the extracting times was 3.The yield of bergenin could achieve 6.429%，exhibiting a good agreement with the predicted value.

Rhizoma Bergeniae Scopulosae；bergenin；ultrasonic extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2016）02-0307-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.053

2015－06－01

王星（1987-），男，在讀碩士研究生，研究方向：植物資源開發(fā)利用，E-mail：1771089314@qq.com。

*通訊作者：趙樺（1957-），男，碩士，教授，研究方向：植物資源開發(fā)利用，E-mail：zhaohuahz@126.com。

陜西理工學(xué)院研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（SLGYCX1312）；陜西省重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助（2015）。