徐 成，盧虹玉，章超樺，文彩秀，林海生（廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術研發(fā)分中心（湛江），南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東湛江524088）

牡蠣酶解提取物對D-半乳糖致衰小鼠學習記憶的影響

徐 成，盧虹玉，章超樺*，文彩秀，林海生
（廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術研發(fā)分中心（湛江），南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東湛江524088）

為了探討牡蠣酶解提取物對學習記憶的影響，本研究分別利用五種不同的酶（胰酶、風味酶、中性酶、堿性酶和復合酶）對牡蠣進行酶解。觀察五種酶解提取物對D-半乳糖誘導記憶損傷小鼠的作用，通過Morris水迷宮進行行為學評價，并觀察小鼠體內MDA（丙二醛）和SOD（超氧化物歧化酶）水平。結果表明，5種牡蠣酶解提取物均能在空間記憶獲取階段的最后3 d顯著縮短小鼠的潛伏期，其中胰酶和堿性酶酶解提取物分別從第1 d和第2 d開始就顯著（p＜0.05）縮短潛伏期；在空間探索階段5種牡蠣酶解提取物的目標象限百分比（胰酶組和中性酶組p＜0.05，其余各組均為p＜0.01）和穿越平臺次數(shù)（胰酶組、復合酶組和中性酶組為p＜0.05，其余各組為p＜0.01）均顯著提高。與模型組相比，胰酶、風味酶以及復合酶酶解提取物顯著降低（p＜0.05）小鼠血清MDA含量；除了風味酶其他酶解提取物顯著（胰酶和堿性酶組p＜0.05；復合酶和中性酶組p＜0.01）提高小鼠血清SOD含量。因此，牡蠣酶解提取物能有效地改善D-半乳糖誘導的記憶損傷，為開發(fā)具有改善記憶功能的牡蠣保健品提供了依據(jù)。

牡蠣，D-半乳糖，學習記憶

Key words:oyster；D-gal；learning and memory

學習記憶是人類大腦最重要的功能之一，很大程度上決定著人們的生活質量。與學習記憶緊密聯(lián)系的機理學說眾多，氧化應激學說就是廣泛受到人們關注的機理之一。氧化應激學說是指機體中氧化產物和抗氧化防御物質不能達到平衡，從而導致氧化應激的產生，引起神經元細胞凋亡，影響神經遞質正常水平等，從而導致學習記憶的損傷［1］。

目前國內外發(fā)現(xiàn)了大量的從動植物種提取出的具有改善學習記憶的活性物質，其中來源于海洋的活性物質由于其資源豐富、活性多而越來越受到人們的關注。目前海洋中具有改善學習記憶活性的物質主要有富含多不飽和脂肪酸的魚油［2］、磷蝦中的復合神經酸［3］等。牡蠣是我國主要的經濟貝類之一，味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富，具有“海洋牛奶”的美稱。大量研究表明，牡蠣酶解提取物含有多肽、多糖、牛磺酸等多種活性物質，具有抗氧化［4-7］、抗炎［8］、抗菌［9］、抗疲勞［10］、調節(jié)免疫［11］等活性。本實驗室前期研究表明，牡蠣酶解提取具有增強小鼠學習記憶的作用，但是否能夠改善由慢性氧化應激導致的學習記憶損傷尚不清楚。本研究在前期基礎上，擬采用5種不同的生物酶酶解牡蠣，觀察5種牡蠣酶解提取物對D-半乳糖誘導的小鼠記憶損傷的作用，為牡蠣資源的高值化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣 購自廣東省湛江市東風市場；昆明小鼠（6～8周齡，雄性） 許可證號SCXK（粵）2013-0002，購自廣東醫(yī)學院SPF級動物房；胰酶（4000 u/g）、風味酶（2萬u/g）、堿性酶（20萬u/g）、中性酶（5萬u/g）和復合酶（10萬u/g） 均為食品級，廣西南寧龐博生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）劑盒 南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng) 淮北正華生物儀器設備有限公司；MK3酶標儀 MULTISKAN；pH-25數(shù)顯pH酸度計 上?？祪x儀器有限公司；AUY220電子天平 日本島津；CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本日立公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋、JJ-2組織搗碎機 常州澳華儀器有限公司；數(shù)顯恒速攪拌器 上海申生科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣酶解液的制備 將新鮮牡蠣去殼，洗凈瀝干，取1000 g牡蠣肉，勻漿（10000 r/min，2 min）后平均分為5份，分別進行酶解，酶解條件見表1，酶解條件由前期預實驗確定。酶解反應過程中，不斷進行攪拌，加入1 mol/L NaOH保持pH恒定不變，酶解時間為5 h。酶解完成后，水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，10000 r/min離心10 min，取上清液冷凍干燥，-20℃儲存。

1.2.2 牡蠣水解度的測定 采用三氯乙酸沉淀法測定水解度。將牡蠣肉洗凈、瀝干，取3.00 g牡蠣肉采用凱氏定氮（GB 5009.5-2010）法測定總蛋白含量；分別取10 mL的五種酶酶解的牡蠣酶解液以及勻漿液，加入10 mL 12%TCA（三氯乙酸）溶液，水浴中加熱30 min，4000 r/min離心15 min，取上清液，凱氏定氮測定酸溶性蛋白含量。

表1 不同酶的酶解條件Table1 The different enzymatic conditions of the different enzymes

式中：DH：水解度；A：水解后酸溶蛋白含量；B：水解前酸溶蛋白含量；C：總蛋白含量。

1.2.3 動物分組與給藥 70只6～8周齡的昆明小鼠，隨機分為7組（空白組、模型組、胰酶組、風味酶組、中性酶組、堿性酶組、復合酶組），每組10只。除空白組外其余6組均每日頸部皮下注射10%的D-半乳糖（100 mg/kg·d），連續(xù)6周，空白組注射等量的生理鹽水。注射2周后，開始給胰酶組、風味酶組、中性酶組、堿性酶組、復合酶組的小鼠灌胃牡蠣酶解液（7.5 mL/ kg·d），模型組及正常組灌胃等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃6周，進行水迷宮實驗。水迷宮實驗結束后采用頸椎脫臼法犧牲小鼠，取血清待測。

1.3 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗［12］分為空間記憶獲取實驗和空間探索實驗兩個部分。

1.3.1 空間記憶獲取實驗 水迷宮實驗于每日上午8∶00-12∶00時進行。水迷宮深80 cm，直徑為150 cm，水溫維持在22℃左右。每天提前將小鼠置于實驗房間中適應半小時。每天每只小鼠訓練4次，每次以半隨機（semi-random）方式選擇入水點，共訓練5 d，以手托起小鼠令其面向池壁，輕輕放入水中。小鼠在90 s內能尋找到平臺，則記錄其搜尋并登上平臺所需要的時間，即潛伏期（escape latency）。若小鼠在90 s內未能找到平臺，則用手將其引導至平臺，休息20 s，潛伏期記為90 s。每次訓練完成后，將小鼠擦干并置于干的木屑里，減少低體溫形成的應激。

1.3.2 空間探索實驗 第6 d將水池內逃逸平臺撤出，在離平臺最遠的位置將小鼠放入水中，記錄小鼠在目標象限（即原平臺所在象限）滯留時間百分比和90 s內穿越平臺位置的次數(shù)。

1.4 血清SOD活性和MDA的測定

水迷宮實驗完成后（禁食12 h），摘除小鼠眼球取血，4000 r/min 4℃離心10 min，取血清，-80℃保存，用于測定血清的SOD及MDA含量，檢測方法按試劑盒說明書進行操作。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件（Origin Lab公司）中One-way ANOVA方法對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（X±SD），以p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為極顯著。

2 結果與分析

2.1 牡蠣酶解提取物水解度測定結果

通過三氯乙酸沉淀法測得五種酶酶解牡蠣的水解度分別如下：胰酶為36.72%、風味酶為26.22%、中性酶為30.75%、堿性酶為29.12%、復合酶為29.12%。

2.2 Morris水迷宮結果

2.2.1 空間記憶獲取實驗結果 由表2可知，除了模型組小鼠以外，空白組與各酶解提取物組小鼠隨著時間的進行其表現(xiàn)都有不同程度的提高，即各組小鼠的潛伏期時間都隨著訓練的進行而逐漸減小?？瞻捉M與模型組相比較，空白組小鼠的潛伏期從第3 d開始均與模型組的潛伏期具有顯著性的差異（p＜0.05），證明D-半乳糖能夠使正常小鼠在水迷宮中的潛伏期時間增加，對小鼠的學習記憶能力造成損傷。胰酶組從第1 d開始即與模型組具有顯著性差異（p＜0.05），其中第4 d的顯著性達到了極顯著水平（p＜0.01）。堿性酶組從第2 d開始也與模型組具有顯著性差異（p＜0.05），其中第4 d和第5 d的潛伏期與模型組相比均達到了極顯著水平（p＜0.01）。風味酶組從第3 d開始與模型組具有顯著性差異（p＜0.05），其中第4 d的潛伏期與模型組相比顯著性達到了極顯著水平（p＜0.01）。中性酶組從第3 d開始與模型組相比具有顯著性差異（p＜0.05），其中第4 d的潛伏期與模型組的顯著性達到了極顯著水平（p＜0.01）。復合酶組也從第3 d開始與模型組具有顯著性差異（p＜0.05），其中第4 d的潛伏期與模型組相比顯著性達到了極顯著水平（p＜0.01）。通過分析第5 d各酶解提取物組和空白組小鼠的潛伏期可知，各酶解提取物組的小鼠在水迷宮記憶獲取階段均具有與正常組相當?shù)谋憩F(xiàn)（p＞0.05）。

總的來說，在空間記憶獲取階段中D-半乳糖能顯著的損傷正常小鼠的學習記憶能力，而五種不同酶酶解的牡蠣提取物均能有效地緩解D-半乳糖的學習記憶損傷作用，其中胰酶和堿性酶酶解提取物具有較好的作用。

2.2.2 空間探索實驗結果 在空間探索階段，空白組、胰酶組、風味酶組、中性酶組、堿性酶組和復合酶組在目標象限的時間百分比均高于模型組（圖1）。其中，胰酶組和中性酶組的目標象限時間百分比顯著高于模型組（p＜0.05），而風味酶組、堿性酶組和復合酶組的目標象限時間百分比與模型組相比達到了極顯著水平（p＜0.01）。與空白組相比，各酶解提取物組的目標象限百分比都高于空白組，其中堿性酶的目標象限與空白組相比達到了顯著水平（p＜0.05），而復合酶組的目標象限時間百分比與空白組相比達到了極顯著水平（p＜0.01）。

圖1 牡蠣酶解提取物在探索階段對小鼠目標象限時間百分比的影響Fig.1 Effect of the oyster hydrolysates on the percentage of time spent in the target quadrant

圖2 牡蠣酶解提取物在探索階段對穿越平臺次數(shù)的影響Fig.2 Effect of the oyster hydrolysates on the times of crossing platform

表2 牡蠣酶解提取物在訓練階段對小鼠潛伏期（s）的影響Table2 Effect of the oyster hydrolysates on the escape latency of mice（s）in acquisition trail

由圖2可知，與模型組相比，空白組穿越平臺次數(shù)極顯著增加（p＜0.01）；五組酶解提取物組的穿越平臺次數(shù)均顯著提高（p＜0.05），其中風味酶組和堿性酶組與模型組相比顯著性達到了極顯著水平（p＜0.01）。各酶解提取物組的穿越平臺次數(shù)均與空白組相當（p＞0.05），證明各酶解提取物組的小鼠均具有與空白組正常小鼠相當?shù)谋憩F(xiàn)。綜上所述，D-半乳糖能延長正常小鼠的潛伏期時間，降低目標象限百分比以及穿越目標平臺的次數(shù)，證明D-半乳糖損傷了正常小鼠的學習記憶能力；而各酶解提取物能顯著的縮短潛伏期時間，且能顯著增加目標象限百分比和穿越平臺次數(shù)，證明各酶解提取物組能有效地緩解D-半乳糖造成的學習記憶損傷。

2.3 小鼠血清SOD和MDA

由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠血清中的MDA顯著（p＜0.05）高于空白組，而模型組的SOD活力極顯著的低于（p＜0.01）空白組，這表明D-半乳糖引起了正常小鼠血清中MDA的升高和SOD的降低，導致氧化應激的產生。各酶解提取物組均能在不同程度上降低MDA的含量，其中胰酶組和風味酶組與模型組相比有顯著差異（p＜0.05），復合酶組與模型組相比更是達到了極顯著的水平（p＜0.01）。對于血清中的SOD活力來說，各酶解提取物組均能在一定程度上提高SOD的活力，其中胰酶組和堿性酶組的SOD活力顯著的高于模型組（p＜0.05），中性酶組的SOD活力與模型組相比達到了極顯著（p＜0.01）的水平。與空白組相比，各酶解提取物組均能使小鼠血清中的MDA和SOD恢復至空白組小鼠的正常水平（p＞0.05），其中復合酶組的MDA含量相比正常組達到了顯著水平（p＜0.05）。

綜上所述，D-半乳糖顯著的增加了小鼠血清中MDA的含量，并降低了SOD的活力，這表明D-半乳糖引起了正常小鼠的氧化應激，而各酶解提取物組均能在不同程度上降低MDA含量和提高SOD活力，這表明牡蠣酶解提取物能有效地緩解D-半乳糖誘導的氧化應激。

表3 牡蠣酶解提取物對衰老模型小鼠血清中MDA和SOD含量的影響Table3 Effect of oyster enzymatic hydrolysates on MDA and SOD levels in the serum of senile mice

3 討論

Morris水迷宮是目前世界上公認的評價嚙齒目動物空間學習記憶的一種行為學實驗，能夠準確的反映動物的空間學習記憶能力。Morris水迷宮實驗一般包括空間記憶獲取階段和空間探索階段，常用空間記憶獲取階段的潛伏期，以及空間探索階段的目標象限時間百分比和穿越平臺次數(shù)等參數(shù)來衡量空間學習記憶能力。本實驗采用皮下注射方式以100 mg/kg劑量對昆明小鼠進行6周的處理，結果表明D-半乳糖顯著的延長了小鼠的潛伏期長短，降低了小鼠在目標象限出現(xiàn)的百分比以及穿越目標平臺的次數(shù)。大量其他研究也表明，D-半乳糖能引起動物的空間學習記憶損傷。Peng X等［13］連續(xù)7周對wistar大鼠皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg），結果表明模型組大鼠的潛伏期時間要顯著高于正常大鼠，許多類似的研究［14-15］也得到了相同的結果，這些都與本實驗中得到的結果相吻合。本實驗中，各酶解提取物組相對模型組來說均能在不同程度上縮短潛伏期，增加在目標象限的百分比以及穿越平臺次數(shù)，使其恢復到與正常小鼠相當?shù)乃剑@表明牡蠣的酶解提取物能有效地緩解D-半乳糖對小鼠造成的空間學習記憶能力的損傷。

機體中ROS（活性氧簇）產物與抗氧化體系（Antioxidant defences）的平衡狀態(tài)決定了氧化應激的程度?？寡趸w系包括SOD、CAT（過氧化氫酶）以及GPx（谷胱甘肽過氧化物酶）。機體中的ROS產物大部分都是通過抗氧化體系來清除的，當機體中產生ROS產物，SOD通過加速將超氧化物轉化為過氧化氫來清除ROS產物［16］。因此，SOD活力的降低表明機體的氧化應激程度加劇。本實驗中，模型組小鼠血清中的SOD活力相對正常小鼠來說顯著的降低，說明D-半乳糖能降低SOD的活力，使氧化應激程度加劇。MDA是自由基作用于脂質的終產物，MDA的積累能導致蛋白質、脂質以及DNA的損傷，是氧化應激加劇的表現(xiàn)。本實驗中，模型組小鼠的血清MDA含量與正常小鼠相比顯著增加，表明D-半乳糖能導致正常小鼠產生更多的自由基，使得氧化應激狀態(tài)加劇。劉克明等［17］研究表明，對昆明小鼠腹腔注射D-半乳糖（500 mg/kg）45 d后導致小鼠的MDA含量要顯著高于對照組，SOD顯著高于對照組。Yan-Fang Xian等［18］研究證明，小鼠皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg）導致其在Morris水迷宮中表現(xiàn)出學習記憶能力的損傷，且SOD、GSH、CAT的含量顯著降低，而MDA含量顯著增加。本實驗中，各牡蠣酶解提取物組都能在不同程度上提高SOD活力和降低MDA含量，能有效地緩解D-半乳糖誘導的氧化應激。牡蠣是廣泛分布在我國沿海的一種經濟貝類，營養(yǎng)價值豐富，具有“海洋牛奶”的美稱。林海生等［6］研究表明牡蠣蛋白酶解物對羥基自由基和超氧陰離子具有較好的清除作用，具有良好的抗氧化能力。牡蠣良好的抗氧化能力也與本研究中牡蠣酶解提取物能緩解D-半乳糖誘導的氧化應激狀態(tài)的結果相吻合。

因此，由本研究結果可知牡蠣酶解提取物能通過緩解氧化應激來改善D-半乳糖誘導的誘導的學習記憶損傷，其改善記憶的作用機制還需要進一步深入的研究。

4 結論

本研究證明牡蠣酶解提取物能提高小鼠的抗氧化能力，有效地緩解D-半乳糖誘導的氧化應激狀態(tài)，并能在水迷宮行為學實驗中縮短潛伏期，增加目標象限百分比以及穿越目標平臺的次數(shù)，有效地恢復了D-半乳糖引起的學習記憶能力損傷，證明五種酶（胰酶、風味酶、中性酶、堿性酶和復合酶）酶解得到的牡蠣酶解提取物具有改善學習記憶能力，為開發(fā)具有改善學習記憶的牡蠣保健制品提供了理論基礎。

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Effects of enzymatic extractions from oyster on the learning and memory of senile mice induced by D-gal

XU Cheng，LU Hong-yu，ZHANG Chao-hua*，WEN Cai-xiu，LIN Hai-sheng
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Province Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing（Zhanjiang），South China Sea Bio-Resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center，Zhanjiang 524088，China）

To investigate its effect on learning and memory，different enzymatic extractions from oyster were obtained.Oyster was hydrolyzed by five different enzymes（trypsin，flavor enzyme，neutral enzyme，alkaline protease and complex enzyme）.Memory deficit mice were induced by D-gal.Five groups of mice were received 5 different enzymatic extractions by oral administration，respectively.Morris water maze was used to assess the spatial memory.The level of MDA and SOD were examined.The results showed that the escape latency in each group was reduced significantly in the last 3 days.And the escape latency in trypsin group and alkaline protease group was reduced significantly（p＜0.05）in the first day and the second day，respectively.In probe trial，both time spent in target quadrant and numbers of crossing platform were significantly increased （Time spent in target quadrant:trypsin:p<0.05，neutral enzyme:p<0.05，other groups were p<0.01.Numbers of crossing platform:trypsin:p<0.05，neutral enzyme:p<0.05，complex enzyme:p<0.05，other groups were p< 0.01）.The level of MDA in trypsin group（p＜0.05），flavor enzyme group（p＜0.05）and complex enzyme（p＜0.01）group was reduced significantly，respectively；while the level of SOD in all groups，except flavor enzyme group，was increased significantly，respectively（trypsin:p＜0.05 neutral enzyme:p＜0.01 alkaline protease:p＜0.05 complex enzyme:p＜0.01）.This work indicated that oyster enzymatic extractions ameliorate the memory dysfunction induced by D-gal，which suggested that oyster enzymatic extractions might be developed as a new dietary supplement for treatment of age-related diseases.

TS254.1

A

1002-0306（2016）02-0347-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.062

2015－05－29

徐成（1989-），男，碩士研究生，研究方向：水產品高值化利用，E-mail：paulxuxu@hotmail.com。

*通訊作者：章超樺（1956-），男，教授，研究方向：水產品加工及高值化利用，E-mail：zhangch2@139.com。

國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系（CARS-48-07B）。