張先達(dá)，陳奕龍，張丹雁（.深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 580；.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州50006）

HPLC法同時測定南大青葉中5種有效成分的含量

張先達(dá)1，陳奕龍2，張丹雁2
（1.深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518102；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州510006）

目的建立同時測定南大青葉中5種有效成分的高效液相色譜（HPLC）法。方法采用ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為225 nm，柱溫為30℃。結(jié)果2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉紅進(jìn)樣量分別在10.86～217.2、16.21～324.2、11.34～226.8、29.85～597.0、160.5～3 210 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，加樣回收率為98.5%～100.9%，方法學(xué)考察結(jié)果良好。結(jié)論建立的HPLC法簡便快速、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為南大青葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的方法。

南大青葉；HPLC法；有效成分；含量測定

南大青葉為爵床科植物馬藍(lán) Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.的干燥葉或葉及幼嫩莖，苦、咸、大寒，具有清熱解毒、涼血定驚等功效［1］，主要分布于我國華南、西南和華東等地區(qū)，為抗病毒常用中草藥，具有悠久的臨床藥用歷史，但尚未列入地方及國家藥品標(biāo)準(zhǔn)［2］。研究表明南大青葉化學(xué)成分以生物堿類為主，還有黃酮類、蒽醌類、三萜類、甾醇類及氨基酸等，活性成分主要為生物堿類化合物［3］。前期研究表明南大青葉中抗病毒有效成分為2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮［4］、色胺酮及靛玉紅［5］等，但目前尚未有研究對這些有效成分同時進(jìn)行測定，以快速評價南大青葉質(zhì)量優(yōu)劣。因此本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定南大青葉中的5種有效成分，為完善南大青葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1　儀器與試藥

美國戴安SUMMIT P680高效液相色譜儀（包括SUMMIT P680低壓四元泵、ASI-100自動進(jìn)樣器、CHROMELEONTM數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)），UVD170U紫外檢測器，SENCO R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司），MX5精密天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A 1004N電子天平（上海菁海儀器有限公司），CX-500A型高速多功能粉碎機(jī)（上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司）。

流動相用甲醇為色譜純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙腈為色譜純（美國默克公司）；二氯甲烷為分析純（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水為重蒸蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2，4（1H，3H）-喹唑二酮（百靈威科技有限公司，批號LD90M21）；4（3H）-喹唑酮［韶遠(yuǎn)化學(xué)科技（上海）有限公司，批號 E021-093-42A］；2-甲基-4 （3H）-喹唑啉酮（天津希恩思生化科技有限公司，批號M-88830）；色胺酮［韶遠(yuǎn)化學(xué)科技（上海）有限公司，批號E-187-296-28C］；靛玉紅（中國食品藥品檢定研究院，批號110717-200204）。

南大青葉采自廣東、廣西、福建等地，樣品批號及情況詳見表1。以上樣品經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張丹雁教授鑒定，為爵床科馬藍(lán)Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.的干燥葉及幼嫩莖。

2　方法與結(jié)果

2.1混合對照品溶液的制備

分別精密稱取2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉紅對照品適量，置于20 mL容量瓶中，加甲醇-二氯甲烷（體積比80∶20）溶解并制成每1 mL含2，4（1H，3H）-喹唑二酮10.86 μg、4（3H）-喹唑酮16.21 μg、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮11.34 μg、色胺酮29.85 μg、靛玉紅160.5 μg的混合對照品溶液。

表1　30批南大青葉的批號、來源信息表Table 1 Sample numbers and sources of 10 batches of leaves of B.cusia

2.2供試品溶液的制備

取南大青葉粉末（過3號篩）1.0 g，置于索氏提取器中，精密稱定，加二氯甲烷120 mL提取至無色，回收提取液蒸干溶媒，殘渣用甲醇-二氯甲烷（體積比80∶20）分次溶解并定容至25 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3色譜條件

色譜柱:ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相:乙腈（A）-水（B）梯度洗脫，程序?yàn)?～20 min，8%A→20%A；20～25 min，20%A →40%A，保持5 min；30～55 min，40%A→90%A，保持10 min。流速:1 mL/min；檢測波長:225 nm；柱溫:30℃；進(jìn)樣量:10 μL。分別精密吸取混合對照品、供試品溶液10 μL，按上述色譜條件測定，結(jié)果見圖1。5種成分與相鄰成分的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)不低于4 000。

圖1　混合對照品（A）、南大青葉供試品（B）溶液的高效液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of the control（A）and test sample（B）

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系的考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，分別按“2.3”項(xiàng)下條件測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

2.4.2精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各成分峰面積。結(jié)果2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉紅峰面積的RSD值分別為1.6%、1.7%、1.9%、1.2%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號: N1），分別于0、1、4、8、12、24 h時各進(jìn)樣1次，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定并記錄峰面積。結(jié)果2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4 （3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉紅峰面積的RSD值分別為1.2%、1.9%、1.2%、1.3%、1.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（批號:N1）南大青葉粉末6份，每份2.0 g，精密稱定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定并記錄峰面積。結(jié)果2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉紅峰面積的 RSD值分別為1.4%、1.1%、1.3%、1.1%、1.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn) 取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)［2，4 （1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4 （3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為31.77、48.86、16.39、85.38、340.2 μg/g］的南大青葉粉末0.8 g，共6份，精密稱定，分別精密加入“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液5.00 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法測定，計算加樣回收率及平均加樣回收率，5種有效成分的加樣回收率在95%～105%之間，結(jié)果見表3。

2.4.6樣品的測定 分別取表1中30批南大青葉樣品各1.0 g，精密稱定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，每份南大青葉樣品平行檢測3次，見表4。

從表4可以看出，30批樣品之間同一成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大:N13與N19批次的2，4（1H，3H）-喹唑二酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差達(dá)9倍；而同一產(chǎn)地之間不同批次樣品同一成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大多相對較為接近。其中，2，4（1H，3H）-喹唑二酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮及靛玉紅質(zhì)量分?jǐn)?shù)均以廣州地區(qū)所產(chǎn)較高，4（3H）-喹唑酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)則以福建仙游地區(qū)所產(chǎn)為高。

表2　南大青葉中5種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果Table 2 The linear relationship results of 5 components in leaves of B.cusia

表3　南大青葉中5種有效成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery results of 5 effective components from leaves of B.cusia（n=6）

3　討論

3.1供試品溶液提取溶劑的選擇

南大青葉化學(xué)成分主要以生物堿類為主，此外還有蒽醌類、黃酮類、三萜類、甾醇類及氨基酸等非生物堿類成分?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，南大青葉中的活性成分主要為生物堿類化學(xué)成分，且有活性的幾種生物堿類成分從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看極性相對較?。?］。本試驗(yàn)對比了三氯甲烷與二氯甲烷的提取效果，發(fā)現(xiàn)2種溶劑提取效果基本相同，考慮到三氯甲烷毒性較大，因而選擇二氯甲烷作為提取溶劑。

3.2測定指標(biāo)的選擇

2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮、靛玉紅及靛藍(lán)均為南大青葉中所含的生物堿類成分，且經(jīng)研究證實(shí)具有一定的藥理活性，在南大青葉藥材中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高且穩(wěn)定，因此被選為測定指標(biāo)［6-8］。

本試驗(yàn)采用HPLC法，以線性梯度洗脫方式進(jìn)行洗脫，研究了不同批次南大青葉藥材的HPLC色譜圖。按本法測定所得30批南大青葉樣品圖譜的特征性和專屬性均很強(qiáng)、共有峰的穩(wěn)定性良好、精密度及重復(fù)性均良好，符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于南大青葉藥材中2，4（1H，3H）-喹唑二酮、4（3H）-喹唑酮、2-甲基-4（3H）-喹唑啉酮、色胺酮和靛玉紅5種化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的同時測定。

表4　30批南大青葉中5種指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 4 Contents of 5 index components in 30 batches of leaves of B.cusia samples（n=3）　w/（μg·g-1）

［1］楊秀賢，呂曙華，吳壽金.馬藍(lán)葉化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，1995，26（12）:622-622.

［2］陳曉慶.南板藍(lán)（馬藍(lán)）栽培的關(guān)鍵技術(shù)研究［D］.廣州:廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2012:3-4.

［3］劉遠(yuǎn)，歐陽富，于海洋，等.馬藍(lán)葉化學(xué)成分研究［J］.中國藥物化學(xué)雜志，2009，19（4）:273-275.

［4］安益強(qiáng)，賈曉斌，陳妍樺，等.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地板藍(lán)根中2，4（1H，3H）喹唑二酮含量［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2010（2）:275-277.

［5］李玲，董同義，李修祿，等.大青葉類藥材及其制劑質(zhì)量控制的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，1994，29（2）:128-131.

［6］李玲，喬傳卓，李修祿，等.大青葉和板藍(lán)根藥材及其制劑質(zhì)量控制的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，1993，28（3）:229-233. ［7］孫立新，寧黎麗，畢開順，等.板藍(lán)根和大青葉質(zhì)量的化學(xué)模式識別研究［J］.中藥材，2000，23（10）:609-613.

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［9］沈小莉.二氫吡啶類衍生物的合成研究及大青葉等藥材中三種有效成分的測定［D］.西安:西北大學(xué)，2007:45.

（責(zé)任編輯：劉曉涵）

Simultaneous determination of 5 active components in leaves of Baphicacanthus cusia （Nees）Bremek.by HPLC

ZHANG Xianda1，CHEN Yilong2，ZHANG Danyan2
（1.Baoan Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518102，China；2.School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

Objective To establish the HPLC method for simultaneous determination of 5 active components in leaves of Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.Methods A ZORBAX Extend-C18column（4.6 mm×250 mm，5 μm）was used and eluted gradiently with the mobile phase of acetonitrile and water at a flow rate of 1 mL/min.The detection wavelength was 225 nm and the column temperature was 30℃.Results 2，4 （1H，3H）-quinazolinedione，4（3H）-quinazolinone，2-methyl-4（3H）-quinazolinone，tryptamine ketone and indigo showed good linearities within the range of 10.86-217.2 ng，16.21-324.2 ng，11.34-226.8 ng，29.85-597.0 ng and 160.5-3 210 ng，respectively.The recovery of them were among 98.5%-100.9%. Conclusion The established HPLC method is simple，rapid，reproducible，accurate and reliable，which could be used to control the quality standard of leaves of B.cusia.

leaves of Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek.；HPLC；effective components；content determination

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0449-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051002

2016-05-10

廣東省科技計劃項(xiàng)目（2010B030700067）

張先達(dá)（1975—），男，主管藥師，Email:71203955@qq.com；通信作者:張丹雁（1964—），女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥品種及真?zhèn)舞b別研究和中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，電話:02039358296，Email:danyan64@163.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-06 10:41 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160706.1041.003.html