靛玉紅的提取分離和藥理研究進(jìn)展

馬夢(mèng)雪 寧 夏 劉華石

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036

靛玉紅(Indirubin)又名玉紅片、炮彈樹(shù)堿B，在結(jié)構(gòu)上稱(chēng)為2-(2-氧代-1H-吲哚-3-亞基)-1H-吲哚-3-酮，是一種新型雙吲哚類(lèi)化合物，具有一定弱堿性，其分子式為C16H10N2O2，相對(duì)分子質(zhì)量262.2628。化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 靛玉紅化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

靛玉紅為暗紅色針狀結(jié)晶，密度1.417 g/cm3，熔點(diǎn)350 ℃，溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、乙醚，微溶于乙醇，不溶于水[1]。天然靛玉紅主要存在于十字花科植物菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的根和葉即板藍(lán)根(Isatidis radix)和大青葉(Isatidis folium)，爵床科植物馬藍(lán)(Baphicacanthuscusia(Nees)Bremek.)的根和根莖即南板藍(lán)根以及蓼科植物蓼藍(lán)(PolygonumtinctoriumAit.)即大青葉這些藥用植物中。靛玉紅具有抗癌作用，由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以阻斷腫瘤細(xì)胞 DNA的合成而具有抗腫瘤活性，且毒副作用很低，所以有大量的國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道靛玉紅及其衍生物的各種藥理學(xué)作用和機(jī)理，如抗菌消炎、抗增殖、抗腫瘤和抗病毒等生物學(xué)效應(yīng)[2-8]，受到越來(lái)越多的關(guān)注。隨著科技的進(jìn)步發(fā)展，靛玉紅提取分離也由有效成份損失過(guò)多的水煎煮醇沉逐步變成經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且能提高提取率的方法。本文綜述了近年靛玉紅的提取分離及藥理作用的研究進(jìn)展，為后續(xù)的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 靛玉紅的提取分離

提取分離板藍(lán)根和南板藍(lán)根中的靛玉紅可采用回流提取法[9-10]和超聲輔助提取法[11]，兩種方法提取效率較高、操作相對(duì)簡(jiǎn)便、成本稍低廉、效率也較高，減壓輔助提取[12]和真空輔助熱回流提取法[13]，可以在低溫下提取靛玉紅，不但節(jié)能、提取效率更高，還可以防止有效成分氧化。復(fù)方板藍(lán)根等已上市制劑，靛玉紅常采用水煎煮或者回流提取[14]，因此有較大的工藝提升空間。

靛玉紅常以乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)試劑作為提取溶劑，采用回流或超聲法進(jìn)行提取，提取液采用氧化鋁和硅膠G干柱等柱色譜進(jìn)行分離和純化[15-20]，靛玉紅的純度可高達(dá)97.78%。已上市的芪藍(lán)囊病飲中靛玉紅用氯仿振搖來(lái)提取[21]，北京市《醫(yī)療單位制劑規(guī)程》收載的口腔潰瘍散II號(hào)采用N，N-二甲基甲酰胺作為靛玉紅的提取溶劑，采用超聲提取進(jìn)行[22]。相關(guān)提取工藝條件和靛玉紅的提取率見(jiàn)表1。

2 靛玉紅藥理作用研究

2.1 抗癌作用

2.1.1 慢性粒細(xì)胞白血病 靛玉紅是我國(guó)首創(chuàng)的可以對(duì)抗白血病的中藥提取物，現(xiàn)在主要用于治療慢性粒細(xì)胞白血病(CML)。高淑香[23]臨床采用靛玉紅治療26例CML患者，發(fā)現(xiàn)血液學(xué)緩解效果較好，總血液學(xué)緩解16例61.5%。Zhou Chao[24]和劉存等[25]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)篩選出青黛中的靛玉紅可以通過(guò)改變靶蛋白PIK3CA，MYC，JAK2，和TP53的表達(dá)在CML耐藥中發(fā)揮作用，JAK2很可能是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，降低其表達(dá)來(lái)干預(yù)K562細(xì)胞的增殖。

2.1.2 乳腺癌 吳瓊等[26]發(fā)現(xiàn)靛玉紅可以通過(guò)抑制細(xì)胞增值或者引起凋亡來(lái)抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過(guò)降低P-gp耐藥蛋白的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。況秀平[27]進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)靛玉紅對(duì)乳腺癌有抑制作用，機(jī)制研究表明，是通過(guò)促進(jìn)GSK-3β的Ser 9位點(diǎn)磷酸化上調(diào)PTGS2，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡作用來(lái)抗乳腺癌。

2.1.3 前列腺癌 魏云飛等[28]研究靛玉紅對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細(xì)胞的殺傷作用及可能的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)靛玉紅降低前列腺癌細(xì)胞的存活率呈濃度依賴性，且能抑制細(xì)胞周期進(jìn)展關(guān)鍵調(diào)控蛋白cyclin D1，及與之相關(guān)Wnt信號(hào)通路的下游基因c-myc的表達(dá)。

2.1.4 神經(jīng)膠質(zhì)瘤 張濤等[29]和Li Zhaohui等[30]先后都發(fā)現(xiàn)靛玉紅可以通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抑制作用。此外，后者還發(fā)現(xiàn)靛玉紅對(duì)所有膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有抑制作用，其中對(duì)U87和U118膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制生長(zhǎng)的作用，機(jī)制為自噬和凋亡性細(xì)胞死亡，創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)也表明，靛玉紅顯著降低U87和U118細(xì)胞的遷移能力，具有抗轉(zhuǎn)移潛能。

2.1.5 卵巢癌 Chen Lihong等[31]研究靛玉紅在人卵巢癌細(xì)胞增殖中的作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)靛玉紅能致使磷酸化的STAT3水平降低，抑制下游的促生存蛋白，提高促凋亡蛋白來(lái)抑制卵巢癌細(xì)胞活性，表明靛玉紅在治療人類(lèi)卵巢癌方面有一定潛力，有待進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。

2.2 抗炎作用

2.2.1 潰瘍性結(jié)腸炎 李楠等[32]研究靛玉紅對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，發(fā)現(xiàn)大鼠DAI評(píng)分降低，結(jié)腸HE染色病理顯示炎癥細(xì)胞明顯減少，TGF-β1水平降低，ITF mRNA表達(dá)升高，說(shuō)明靛玉紅有抑制炎癥的效果，可以改善UC模型大鼠癥狀、結(jié)腸病理形態(tài)。臧思源[33]應(yīng)用脂多糖誘導(dǎo)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)靛玉紅能夠降低促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-12、IL-6表達(dá)量的同時(shí)增加抑炎細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)量，還可抑制NF-κB和PI3K/AKT信號(hào)通路活性，作用于多個(gè)治療靶點(diǎn)。Naruo Tokuyasu等[34]和梁艷妮等[35]先后研究靛玉紅對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)所導(dǎo)致的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的影響，發(fā)現(xiàn)DAI評(píng)分降低，結(jié)腸組織損傷減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，IL-6水平顯著降低。此外，后者還發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子IL-8、IL-1β和TNF-α水平顯著降低，抗炎細(xì)胞因子IL-10水平升高，16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示，小鼠腸道菌群多樣性升高，在門(mén)水平主要表現(xiàn)為擬桿菌門(mén)與厚壁菌門(mén)比例回升，都說(shuō)明了靛玉紅可以用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。

2.2.2 牛皮癬(銀屑病) Xue Xiaochun等[36]研究靛玉紅對(duì)銀屑病皮損的抑制作用，發(fā)現(xiàn)CD274是靛玉紅介導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損效應(yīng)的調(diào)節(jié)因子，有助于減輕小鼠銀屑病樣皮損。Nguyen Ly Thi Huong等[37]發(fā)現(xiàn)靛玉紅可能通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS的生成及其細(xì)胞中ICAM-1等炎性因子的生成，和降低IL-22處理的HaCaT細(xì)胞進(jìn)入S期的比例以及下調(diào)銀屑病皮損中K16的表達(dá)，對(duì)IL-22誘導(dǎo)的銀屑病模型起到治療作用。

2.2.3 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 Huang Mingcheng等[38]旨在探討靛玉紅對(duì)類(lèi)風(fēng)濕患者成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA FLS)的抑制作用，發(fā)現(xiàn)靛玉紅可以降低RA-FLSs的遷移、侵襲、炎癥和增殖，且證實(shí)在細(xì)胞遷移過(guò)程中抑制了板狀偽足的形成，深入了解分子機(jī)制還發(fā)現(xiàn)靛玉紅抑制了PAK1和MAPK的活性。

2.2.4 乳腺炎 賴金倫[39]研究發(fā)現(xiàn)靛玉紅可以通過(guò)抑制TLR4 介導(dǎo)的 NF-κB和 MAPKs信號(hào)通路抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和MPO的表達(dá)，發(fā)揮對(duì) LPS 誘導(dǎo)小鼠乳腺炎的治療和保護(hù)作用，機(jī)制如圖2所示，發(fā)揮對(duì) LPS 誘導(dǎo) MMECs 凋亡的抑制作用，起到抗炎作用。

圖2 靛玉紅抑制TLR4介導(dǎo)的NF-κB和MAPK發(fā)揮對(duì)LPS誘導(dǎo)MMECs和小鼠乳腺炎具有防治作用示意圖

2.3 抗病毒 Yang Ying等[40]將HepG2.2.15細(xì)胞系作為體外細(xì)胞模型首次證實(shí)了靛玉紅具有抗病毒能力，能有效抑制HBV抗原(HBsAg和HBeAg)和HBV DNA的分泌，還能顯著降低HBsAg和PTB蛋白水平，可用于治療HBV感染。 Jie Chong等[41]建立了小鼠H1N1易感性模型，發(fā)現(xiàn)靛玉紅降低了小鼠流感病毒的易感性、死亡率且減輕小鼠抑制應(yīng)激模型的肺損傷，機(jī)制如圖3所示，促進(jìn)了干擾素-β和干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白3的表達(dá)，表明其可能是一種治療流感的候選藥物。

圖3 靛玉紅誘導(dǎo)的H1N1發(fā)病機(jī)制在易感模型中的衰減機(jī)制示意圖

2.4 其他

2.4.1 心臟保護(hù)作用 Zheng Suxia等[42]研究了靛玉紅對(duì)異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)的Wistar大鼠心肌梗死心臟標(biāo)志物的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)LDH(1、2)同工酶條帶表達(dá)增強(qiáng)，心臟和血漿中LPO的水平改善，證實(shí)了其顯著的保護(hù)作用，與靛玉紅治療大鼠的組織病理學(xué)研究結(jié)果一致，表明大鼠心肌梗死明顯恢復(fù)。

2.4.2 治療血液病-血小板減少 Zhao Yajing等[43]研究發(fā)現(xiàn)靛玉紅能顯著增加Treg的數(shù)量和功能，并以劑量依賴性的方式抑制效應(yīng)T細(xì)胞的激活，還可恢復(fù)ITP患者CD4+T細(xì)胞上PD1和PTEN的表達(dá)，導(dǎo)致隨后AKT/mTOR通路的減弱，確定了靛玉紅通過(guò)PD1/PTEN/AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)來(lái)治療ITP的一種潛在新機(jī)制。Shao Kai等[44]從19名ITP成年患者和20名健康對(duì)照(HCs)中分離出PBMCs，發(fā)現(xiàn)用靛玉紅進(jìn)行治療對(duì)PBMC活力沒(méi)有細(xì)胞毒性作用，顯著增強(qiáng)了ITP患者PBMCs中MPL表達(dá)，抑制TNF表達(dá)從而降低ITP的炎癥反應(yīng)而在血小板生成中發(fā)揮直接作用。

2.4.3 治療肺纖維化 Wang Qi等[45]研究靛玉紅對(duì)博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化的影響，發(fā)現(xiàn)靛玉紅治療后的小鼠存活率明顯提高，并呈劑量依賴性，且顯著減輕炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)以劑量依賴性的方式抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化。

3 結(jié)語(yǔ)

隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)靛玉紅不斷的深入研究，新的藥理作用和機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)及臨床對(duì)于靛玉紅的需求越來(lái)越大，探求經(jīng)濟(jì)高效且簡(jiǎn)潔的提取分離方法一直是研究的熱點(diǎn)，但目前多為實(shí)驗(yàn)室級(jí)別，需要進(jìn)行放大以便工業(yè)化生產(chǎn)，過(guò)程中必會(huì)產(chǎn)生一些問(wèn)題，等待解決和完善。

靛玉紅雖有廣泛的藥理作用，但其在水和油中的溶解性低，口服吸收有限，生物利用度低，導(dǎo)致臨床療效較慢，對(duì)其進(jìn)一步的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)被限制。目前已有研究團(tuán)隊(duì)研究出了很多增加溶解性和提高生物利用度的方法，例如合成新的衍生物，對(duì)靛玉紅3’位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，引入羥肟；藥對(duì)配伍間的增溶作用，青黛和甘草；以及新型的給藥系統(tǒng)，靛玉紅白蛋白納米粒、脂質(zhì)體和自微乳等，這些都為靛玉紅后續(xù)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和劑型改進(jìn)提供了依據(jù)。優(yōu)化后的靛玉紅衍生物其分子機(jī)制和作用機(jī)理都不甚明確，可對(duì)此進(jìn)行深入研究，為持續(xù)的新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)。