梁桂娟，尋思穎，張　瓊，李紅洲

LC-MS/MS法測(cè)定食用油中的辣椒素和二氫辣椒素

梁桂娟，尋思穎*，張瓊，李紅洲

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，貴州 貴陽(yáng) 550016）

建立了用氨基固相萃取小柱凈化提取液，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測(cè)定食用油中辣椒素和二氫辣椒素含量的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，辣椒素在0～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 6），平均回收率在70.6%～90.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）在3.1%～8.9%，檢出限為0.03 μg/kg；二氫辣椒素在0～20 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 8），平均回收率在71.5%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）在6.0%～13.2%，檢出限為0.006 μg/kg。該方法簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠，是鑒別地溝油和測(cè)定食用油中辣椒素類物質(zhì)的有效方法。

固相萃?。灰合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜；食用油；辣椒素；二氫辣椒素

正常食用油中幾乎不含辣椒素類物質(zhì)，但一些不法商販為獲取暴利，把地溝油添加到正常食用油中，以假亂真。地溝油是各類廢棄劣質(zhì)油脂的統(tǒng)稱［1］，其中來(lái)自餐飲業(yè)的泔水油是其主要成分，也包括煎炸廢油、食品及相關(guān)企業(yè)產(chǎn)生的廢棄油脂等。地溝油含有多種有害成分，長(zhǎng)期食用易對(duì)人體產(chǎn)生巨大的傷害［2］，其鑒別及有效的檢測(cè)方法已成為我國(guó)食品安全領(lǐng)域亟須解決的問(wèn)題。由于我國(guó)居民的飲食習(xí)慣，辣椒是餐飲業(yè)中使用量較大的調(diào)味料，而辣椒的主要辣味成分是天然辣椒堿，該物質(zhì)由14種辣椒素同位素組成，其中辣椒素和二氫辣椒素的總含量占辣椒堿的90%以上［3］。辣椒素類物質(zhì)具有脂溶性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、沸點(diǎn)高等特點(diǎn)，目前的地溝油加工工藝很難完全除去這類物質(zhì)，而接觸過(guò)辣椒的餐廚廢棄油脂幾乎難免含有這種成分，因此可將辣椒素類物質(zhì)作為鑒別餐廚廢棄油脂的特征指標(biāo)［4-6］。

我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［7-9］中及文獻(xiàn)方法［10］檢測(cè)辣椒素類物質(zhì)的方法主要是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和分光光度法，適用于辣椒或以辣椒為主要原料的辣椒制品進(jìn)行常量或微量的定量檢測(cè)，檢出量一般為g/kg級(jí)，最低檢出限均為mg/kg。由于地溝油在經(jīng)過(guò)水洗、蒸餾、脫色、除臭等加工處理，且不法商販將之以一定比例滲入正常食用油后，大大降低了油脂中殘留的辣椒素類物質(zhì)的含量，因此常量檢測(cè)方法很難將其檢測(cè)出來(lái)。文獻(xiàn)報(bào)道了幾種用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測(cè)油脂中辣椒素類物質(zhì)的方法［11-15］，檢出限均能達(dá)到μg/kg級(jí)甚至ng/kg級(jí)，用于地溝油的鑒別分析，均取得了良好效果。王龍星等［11-12］利用辣椒素類物質(zhì)含有酚羥基的特征，先用堿液萃取油脂中的辣椒素類物質(zhì)，再將萃取液過(guò)HLB固相萃取小柱進(jìn)行凈化，該方法能有效除去油脂基質(zhì)，但操作過(guò)程較為繁瑣耗時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性不理想。張忠等［13］用甲醇提取油脂中的辣椒素類物質(zhì)后直接進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，雖然簡(jiǎn)單快速，但不能有效除去油脂基質(zhì)，容易污染儀器，且檢出限較高。趙琴等［14］采用Benzo I填料作為吸附劑，利用辣椒素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)中含有極性較強(qiáng)的酚羥基和酰胺基團(tuán)，在非極性環(huán)境中能保留在吸附劑上的特點(diǎn)，一步凈化提取液，不僅能有效除去油脂基質(zhì)，且操作簡(jiǎn)便易行，但裝填吸附劑費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且是否裝填均勻?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，不適合大批量的樣品檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)在參考相關(guān)文獻(xiàn)及反復(fù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法測(cè)定食用油中辣椒素和二氫辣椒素含量，選擇具有極性固定相和弱陰離子交換劑雙重作用的硅膠氨基萃取柱Classic-NH2作為固相萃取小柱凈化提取液，用甲醇洗脫目標(biāo)物及空白基質(zhì)加標(biāo)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線并用二苯胺做內(nèi)標(biāo)，以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)及校正儀器波動(dòng)引起的測(cè)定誤差。該方法的建立，將有效提升檢測(cè)辣椒素和二氫辣椒素的技術(shù)水平，為地溝油的綜合判定提供可靠的技術(shù)保證。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

色拉油：市售；辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%，分子式C18H27NO3，CAS號(hào)：404-86-4）：南京多隆生物科技有限公司；二氫辣椒素（純度＞98%，分子式C18H29NO3，CAS號(hào)：19408-84-5）：上海樊克生物科技有限公司；二苯胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%，分子式C12H11N，CAS：122-39-4）：上海常斤生物科技有限公司；0.22 μL有機(jī)濾膜：上海澤孚實(shí)業(yè)有限公司。

甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷（均為分析純）：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；甲醇、甲酸（色譜純）：美國(guó)默克公司；Classic-NH2陰離子交換固相萃取小柱（規(guī)格1 000 mg/6 mL）：德國(guó)Simon Aldrich公司，使用前用5 mL甲醇、3 mL丙酮和3 mL正已烷依次活化。

1.2儀器與設(shè)備

YP202N型電子天平（感量0.01 g）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；AB4000Qtrap液質(zhì)聯(lián)用儀（帶Agilent1260高效液相色譜儀）：美國(guó)AB公司；Mnltireax振蕩混勻器：Heielolph公司；TurboVap氮吹儀：美國(guó)Biotage公司；固相萃取裝置：美國(guó)Agilent公司。DSY-Ⅲ氮吹儀：北京金科精華苑科技有限公司；90-2磁力攪拌器：上海振榮科學(xué)儀器有限公司；QL-901漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1質(zhì)譜條件

根據(jù)辣椒素、二氫辣椒素及二苯胺的結(jié)構(gòu)特征，選擇ESI（+）正離子電離模式。通過(guò)對(duì)幾種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和二級(jí)質(zhì)譜掃描，優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量和其他參數(shù)，最終確定優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)為：霧化溫度650℃；氣簾氣（氮?dú)猓┝髁浚?5 L/h；噴霧電壓500 V；霧化氣流量60 L/h；輔助氣流量60 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiplereaction monitoring，MRM）模式質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1　辣椒素、二氫辣椒素及二苯胺的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectra parameters of capsaicin，dihydrocapsaicin and diphenylamine

1.3.2高效液相色譜條件

Agilent SB C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，4.6 μm）；流速0.8 mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和甲醇溶液梯度洗脫，洗脫梯度程序見(jiàn)表2。

表2　流動(dòng)相梯度洗脫參數(shù)Table 2 Gradient elution parameters of mobile phase

1.3.3樣品前處理

提?。悍Q取2.5 g樣品（精確至0.01 g），加入10 mL正己烷，在渦旋混勻器上充分混勻后作為上樣液待凈化。

凈化：將上樣液全部吸入經(jīng)活化后的固相萃取小柱，殘留樣液用正己烷清洗后并入固相萃取小柱，流速不超過(guò)1.0 mL/min。上樣液全部過(guò)柱后，先用5 mL含體積分?jǐn)?shù)為20%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗小柱，再用5～10 mL含體積分?jǐn)?shù)為80%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗，抽干淋洗液，用4 mL甲醇溶液洗脫，洗脫液用氮吹儀于40℃條件下吹干，最后用1 mL質(zhì)量濃度為5 μg/L的二苯胺甲醇溶液充分渦旋混勻，過(guò)0.22 μm微孔有機(jī)濾膜供高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

（1）辣椒素和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取0.1 g（精確至0.000 1 g）辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品和二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后定容至100 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20℃條件下保存。

（2）二苯胺內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取10 mg二苯胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解后定容至100mL，配制成100μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，于-20℃條件下保存。臨用時(shí)用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為5μg/L的內(nèi)標(biāo)使用液。

（3）混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的配制

移取不同體積的辣椒素、二氫辣椒素和二苯胺儲(chǔ)備液，用甲醇配制成辣椒素質(zhì)量濃度為0.1 μg/L、0.5 μg/L、2.5μg/L、10.0μg/L、25.0μg/L、50.0 μg/L、100.0μg/L，二氫辣椒素質(zhì)量濃度為0.02 μg/L、0.10 μg/L、0.50 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.00 μg/L、20.00 μg/L，二苯胺質(zhì)量濃度為5 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

（4）空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液

分別稱取與待測(cè)樣品基質(zhì)相同的、不含所測(cè)辣椒素和二氫辣椒素的陰性油脂樣品7份于50 mL具塞離心管中。經(jīng)過(guò)樣液提取和凈化步驟，分別加入1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，渦旋混勻，配制成上述質(zhì)量濃度的空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列使用液。

1.3.5定性定量方法

1.4.2 治療因素：治療有效是支持診斷的重要依據(jù)。而診斷性治療(試驗(yàn)性治療)更是鑒別診斷的常用方法。但即使治療方案是合理的，療效也不可能百分之百。而治療引起的不良反應(yīng)以及藥物對(duì)癥狀體征和輔助檢查結(jié)果的影響都會(huì)干擾診斷[3]。

本方法用保留時(shí)間及離子對(duì)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行定性，二苯胺內(nèi)標(biāo)法定量。其中，標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測(cè)溶液的保留時(shí)間偏差在2.5%以內(nèi)。

2　結(jié)果與分析

2.1樣品前處理方法

2.1.1提取及凈化方法

采用正己烷溶解油脂，直接上Classic-NH2柱進(jìn)行凈化。Classic-NH2是一種以硅膠為基質(zhì)的氨基萃取柱。它具有極性固定相和弱陰離子交換劑，可通過(guò)弱陰離子交換（水溶液）或極性吸附（非極性有機(jī)溶液）達(dá)到保留作用，具有雙重作用。當(dāng)用在非極性溶液中（如正已烷）進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，它能與帶有-OH、-NH、-SH官能團(tuán)的分子形成氫鍵。辣椒素和二氫辣椒素具有較強(qiáng)的脂溶性，易溶于正己烷等非極性有機(jī)溶劑，同時(shí)分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基和酰胺基等極性基團(tuán)，可以保留在Classic-NH2柱上，因此，用正己烷溶解含有辣椒素類物質(zhì)的油脂時(shí)，可形成穩(wěn)定均勻的非極性有機(jī)溶液，當(dāng)溶液流過(guò)Classic-NH2時(shí)，含有-OH、-NH的辣椒素類物質(zhì)保留在柱上，而油脂及其余雜質(zhì)則流出小柱，用不同體積分?jǐn)?shù)的乙酸乙酯正己烷溶液充分淋洗殘留在柱上的殘留油脂和其他雜質(zhì)后，再用甲醇洗脫保留在柱上的辣椒素和二氫辣椒素，濃縮后進(jìn)行檢測(cè)。這種前處理方法利用辣椒素類物質(zhì)結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，可一步提取進(jìn)行凈化，大大提高了回收率，而且節(jié)約了有機(jī)溶劑的使用量，縮短了檢測(cè)時(shí)間。此外，由于無(wú)需裝填凈化小柱，保證了填料的均勻性，因此提高了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性。

2.1.2淋洗溶液及洗脫液的選擇

為使上機(jī)樣液盡可能干凈，減少基質(zhì)效應(yīng)和對(duì)儀器的污染，本實(shí)驗(yàn)用不同體積分?jǐn)?shù)的乙酸乙酯正己烷溶液淋洗上樣后的小柱。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯體積分?jǐn)?shù)越高，越容易洗凈殘留在柱上的油脂，考慮到乙酸乙酯對(duì)辣椒素類物質(zhì)有一定的洗脫作用［14］，最終選擇用含乙酸乙酯體積分?jǐn)?shù)分別為20%和80%的正己烷溶液各5 mL依次淋洗。

用常用的兩種洗脫試劑甲醇和乙腈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用甲醇作洗脫劑時(shí)，辣椒素和二氫辣椒素的洗脫率均高于乙腈，這可能是因?yàn)槔苯匪仡愇镔|(zhì)主要是通過(guò)氫鍵作用保留在固相萃取小柱上，而甲醇的分子結(jié)構(gòu)中含有-OH，根據(jù)相似相溶原理，因此甲醇更容易洗脫目標(biāo)物質(zhì)。

2.2定量方法及內(nèi)標(biāo)的選擇

在色譜-質(zhì)譜分析中，由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，目標(biāo)物在純?nèi)軇┖蜆悠诽幚硪褐械捻憫?yīng)有較大差異，同時(shí)，在前處理過(guò)程中目標(biāo)物會(huì)有不同程度的損失。為更真實(shí)地反映實(shí)際樣品中目標(biāo)物的含量，一般會(huì)在樣品中加入該目標(biāo)物的同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正及補(bǔ)償。但辣椒素及二氫辣椒素的內(nèi)標(biāo)物較昂貴，檢測(cè)成本高，不利于方法的普及。因此，本實(shí)驗(yàn)采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方式配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并用保留時(shí)間與二者接近的二苯胺作內(nèi)標(biāo)，以校正儀器波動(dòng)實(shí)驗(yàn)引起的誤差。結(jié)果表明，用這種方法進(jìn)行定量，回收率及實(shí)測(cè)結(jié)果均有明顯提高。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

對(duì)空白基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，辣椒素和二氫辣椒素含量（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比3∶1計(jì)算檢出限，得辣椒素和二氫辣椒素的最低檢測(cè)質(zhì)量濃度分別為0.076 μg/L和0.015 μg/L，按本實(shí)驗(yàn)中的取樣量和定容體積計(jì)算，則樣品中的檢出限分別為0.03 μg/kg和0.006 μg/kg。線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限（detection limit，LOD）見(jiàn)表3，添加目標(biāo)物的油脂樣品的MRM色譜及質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1～圖3。

表3　方法的線性參數(shù)、檢出限Table 3 Linear parameters and detection limit of the method

圖1　辣椒素、二氫辣椒素、二苯胺的LC-MS/MS色譜圖Fig.1 LC-MS/MS chromatogram of capsaicin，dihydrocapsaicin and diphenylamine

圖2　辣椒素MRM的色譜圖（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.2 MRM chromatogram（A）and mass spectra（B）of capsaicin

圖3　二氫辣椒素MRM的色譜圖（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.3 MRM chromatogram（A）and mass spectra（B）of dihydrocapsaicin

2.3.2回收率實(shí)驗(yàn)

在空白油脂樣品中添加低（辣椒素和二氫辣椒素分別為0.25 μg/kg和0.05 μg/kg）、中（辣椒素和二氫辣椒素分別為2.5 μg/kg和0.5 μg/kg）、高（辣椒素和二氫辣椒素分別為25 μg/kg和5 μg/kg）三個(gè)濃度的目標(biāo)分析物，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of standard recovery rate experiments

由表4可知，辣椒素的平均回收率在70.6%～90.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在3.1%～8.9%，二氫辣椒素的平均回收率在71.5%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在6.0%～13.2%，表明本方法準(zhǔn)確性好。

2.3.3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

由兩名檢測(cè)人員在不同時(shí)間測(cè)定同一加標(biāo)樣品，辣椒素加標(biāo)量為1.0 μg/kg，二氫辣椒素加標(biāo)量為0.2 μg/kg，每人重復(fù)測(cè)定3次，考察該方法的重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD在3.5%～6.8%，表明重現(xiàn)性良好，方法穩(wěn)定。

2.4樣品的測(cè)定

表6　食用油中辣椒素和二氫辣椒素的檢測(cè)結(jié)果Table 6 Detection results of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil

用本方法對(duì)市場(chǎng)上6種知名品牌各類食用油進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出辣椒素及二氫辣椒素。為驗(yàn)證方法的適用性，在上述食用油中加入已知辣椒素和二氫辣椒素含量分別為1.92 mg/kg和0.73 mg/kg的辣椒油，以5∶95的比例混勻后按本方法檢測(cè)，結(jié)果（見(jiàn)表6）可知，實(shí)測(cè)值與理論值標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.5%～16.6%，說(shuō)明本方法具有較好的適用性。

3　結(jié)論

本研究建立了固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定食用油中辣椒素和二氫辣椒素含量的方法。樣品用正己烷溶解后，上Classic-NH2硅膠氨基固相萃取小柱凈化，最后用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)樣液中的辣椒素和二氫辣椒素進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，辣椒素在0～100 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 6）平均回收率在70.6%～90.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）在3.1%～8.9%，檢出限為0.03μg/kg；二氫辣椒素在0～20ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.998 8），平均回收率在71.5%～100.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=3）在6.0%～13.2%，檢出限為0.006 μg/kg。本方法操作簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、適用性好，檢出限可達(dá)ng/kg級(jí)，是鑒別地溝油或食用油中是否滲雜地溝油的有效方法。

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Determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil by LC-MS/MS

LIANG Guijuan，XUN Siying*，ZHANG Qiong，LI Hongzhou
（Guizhou Institute of Product Quality Supervision and Determination，Guiyang 550016，China）

A method was established for the determination of capsaicin and dihydrocapsaicin in edible oil by solid phase extraction and LC-MS/MS. Theresultsindicatedthatthecapsaicinshowedgoodlinearrelationshipintherangeof 0-100ng/ml（R2=0.9986），theaveragerecoverywas70.6%-90.5%，and relative standard deviation（RSD，n=3）was 3.1%-8.9%，and the detection limit was 0.03 μg/kg.The dihydrocapsaicin showed good linear relationship in the range of 0-20 ng/ml（R2=0.998 8），the average recovery was 71.5%-100.7%，relative standard deviation（RSD，n=3）was 6.0%-13.2%，and the detection limit was 0.006 μg/kg.The method was simple，rapid，accurate and reliable，and it was an effective method for the identification of waste oil and determination of capsaicin in edible oil.

solid phase extraction；LC-MS/MS；edible oil；capsaicin；dihydrocapsaicin

O657.72

0254-5071（2016）07-0175-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.038

2016-05-24

貴州辣椒技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系（黔衛(wèi)計(jì)辦函［2015］94號(hào)）

梁桂娟（1972-），女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称贩治雠c檢測(cè)。

尋思穎（1963-），女，研究員，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩L(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。