鄧玉杰，馬雪蕾，張凱婷，王　瑞，武　運，張珍珍

新疆不同地區(qū)生產的葡萄酒中八種生物胺含量的測定

鄧玉杰，馬雪蕾，張凱婷，王瑞，武運，張珍珍*

（新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830000）

利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）技術，以丹磺酰氯作為柱前衍生試劑，測定了新疆不同地區(qū)21個市售葡萄酒中的8種生物胺含量。結果表明，不同地區(qū)葡萄酒中的生物胺總含量存在明顯差異，和田地區(qū)葡萄酒中總生物胺含量最少，為37.16 mg/L，吐魯番地區(qū)葡萄酒中生物胺總含量最高，為335.18 mg/L，且不同地區(qū)生產的葡萄酒中各項生物胺種類也存在差異，生物胺中含量最高的是精胺，平均測定含量為87.37 mg/L。通過對葡萄酒中生物胺含量的測定分析，可以為新疆地區(qū)葡萄酒中的生物胺的安全品質控制提供依據。

葡萄酒；不同地區(qū)；生物胺；測定

葡萄酒是用破碎或未破碎的新鮮葡萄果實或葡萄汁為原料經完全或者部分酒精發(fā)酵后獲得酒精度不低于7%vol的發(fā)酵型酒精飲料［1］。葡萄酒中富含很多種類的氨基酸，它們在乳酸菌產生的脫羧酶作用下從而生成組胺、精胺、腐胺、尸胺及苯乙胺等多種生物胺，其中葡萄酒中主要的生物胺為精胺、組胺以及腐胺，甲胺、乙胺、尸胺、苯乙胺和異戊胺等胺類物質存在于發(fā)酵前的葡萄原汁中，但是酵母菌等某些微生物在發(fā)酵過程之中可以把一部分的生物胺降解［2］；當葡萄酒酒精發(fā)酵時期處在以酵母菌為主導時，含量最高的即為釀酒酵母菌株體內的胍基丁胺和乙醇胺，在葡萄酒蘋果酸乳酸發(fā)酵時期，酪胺、組胺、腐胺等生物胺是乳酸菌將氨基酸脫羧而成［3］，除此之外，還含有尸胺及苯乙胺等其他種類的生物胺存在于蘋果酸乳酸發(fā)酵后的葡萄酒中。在對葡萄酒中發(fā)酵過程的生物胺的含量測定結果表明，在酒精發(fā)酵過后葡萄酒中的生物胺含量很低，但在經蘋果酸-乳酸發(fā)酵后，葡萄酒中生物胺的含量發(fā)生不同程度的增高［4-5］。

生物胺具有特定的生物活性［6］，是雜環(huán)類或一類脂肪族的低分子質量含氮堿，在動植物和微生物生理活性細胞中尤為重要，且適量有助于人體正常的生理功能，過量則會對機體的生理產生一定的不良反應，存在致癌風險［7］。除此之外，構成核酸及荷爾蒙等的前體物質也是生物胺，并且生物活性細胞不可或缺的組成部分其中就是腐胺、精胺、亞精胺和尸胺，它們不僅可以調節(jié)核酸與蛋白質的合成，在生物膜穩(wěn)定性方面同樣也發(fā)揮著重要作用［8］，而且一些致癌物質和亞硝基化合物的前體生成物質也是生物胺。大多數食物中的生物胺可能對人的機體有一定的不良影響，如芳香族生物胺（酪胺和苯乙胺等），可引起偏頭痛和高血壓［9-10］，其中組胺為危害性最大的生物胺，許多國家已經作出了葡萄酒中組胺的限量范圍。澳大利亞、匈牙利和瑞士規(guī)定≤10mg/L，法國規(guī)定≤8mg/L，荷蘭規(guī)定≤3.5 mg/L，比利時規(guī)定≤5～6 mg/L，德國規(guī)定≤2 mg/L。目前，其檢測和分析方法包括生物傳感器、薄層色譜（thin-layerchromatography，TCL）、毛細管電泳（capillaryelectrophore-sis，CE）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）等方法，其中HPLC具有分析速度快、柱效高、檢測靈敏度高、定量分析準確的特點，是目前食品中生物胺含量分析測定的主要手段［11］。

本實驗主要采用反相高效液相色譜法（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）測定新疆不同區(qū)域和類型的葡萄酒中生物胺種類及含量，獲得新疆產區(qū)葡萄酒中生物胺種類及含量普查數據，以期為葡萄酒中生物胺的研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

不同地區(qū)的干紅葡萄酒：市售；乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；組胺、酪胺、尸胺、乙胺、苯乙胺、精胺、亞精胺、腐胺和丹磺酰氯：美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

1200Series高效液相色譜儀（紫外檢測器）：美國Agient公司；D2155W離心機、MS 3渦旋混勻器：美國Merck公司；DHG-9053A恒溫培養(yǎng)箱：上海鴻都電子科技有限公司；FA2004分析天平：上海天平儀器廠。

1.3試驗方法

1.3.1生物胺標準儲備溶液的配制

分別稱取生物胺各10 mg，用0.l mg/L HC1溶液溶解并轉移到10 mL容量瓶中，用0.l mg/L的HC1溶液定容，作為標準貯備液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们?，根據實驗需要將此標準貯備液用0.1 mg/L HC1溶液配成質量濃度為100 mg/L的標準工作液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2生物胺標準混合溶液的配制

分別吸取1.00 mL各生物胺單組分標準儲備溶液，置于同一個10 mL容量瓶中，用0.1 mg/L鹽酸稀釋至刻度，混勻，配制成生物胺標準混合使用液（100 mg/L）。

1.3.3生物胺標準系列溶液配制

吸取0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.50 mL、5.00 mL生物胺標準混合使用液（100 mg/L），分別置于10 mL容量瓶中，用0.10 mg/L鹽酸溶液稀釋至刻度，混勻，使其質量濃度分別為1.00 mg/L、2.50 mg/L、5.00 mg/L、10.0 mg/L、15.0 mg/L、25.0mg/L、50.0 mg/L。

1.3.4樣品前處理和衍生

試樣提?。喝∑咸丫?0mL向其加入0.2mL（100 mg/L）的內標使用液，再向其中加入NaCl至飽和，移取飽和后的試樣提取液5 mL，置于15 mL離心管中，后用0.1 mg/L的NaOH將其pH值調節(jié)為12，萃取時用5mL正丁醇-氯仿（1∶1，V/V）的溶液提取，再進行旋渦振動5 min，以3 600 r/min的速度再進行10 min的離心。吸取上層有機相后再用等體積的萃取液進行2次提取，合并萃取液后混勻，取3 mL萃取液，加入0.2 mL 1 mg/L鹽酸，混合后40℃水浴條件下用氮氣吹干，再加入1 mL 0.1 mg/L鹽酸溶解殘留物，待衍生。

取0.5 mL樣品提取液，置10 mL具塞試管中，加入1.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液、1.0 mL（5 mg mL丙酮）衍生劑，混合振蕩。置60℃條件下反應30 min（中間振蕩兩次），取出后加入100 μL谷氨酸鈉（50 mg/L飽和碳酸氫鈉溶液），振蕩，60℃條件下保溫15 min。取出每個試管中加入1 mL超純水，40℃水浴下，用氮氣除去丙酮。加入3 mL乙醚，旋渦振蕩器上混合振蕩2 min，靜置，分層后取上層有機相（乙醚層），加重復萃取2次，合并乙醚萃取液，40℃水浴條件下氮氣吹干。加1.0 mL甲醇溶解殘留物，振蕩混合，過0.22 μm（0.45 μm）微孔濾膜，濾液可直接進HPLC測定。

1.3.5高效液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：30℃，紫外檢測波長為254 nm，A相為甲醇，B相為超純水進行梯度洗脫，流速：1.5 mL/min，進樣量為20 μL，以峰面積內標法定量，梯度洗脫條件見表1。

表1　梯度洗脫條件Table 1 Conditions of gradient elution

2　結果與分析

2.1生物胺標準樣品及樣品的測定

由于分子中缺少發(fā)色基團，既無熒光和電化學活性，本身又無紫外吸收，所以只能檢測到衍生后的生物胺。丹磺酰氯作為比較穩(wěn)定的衍生物，同時具有特異的紫外吸收和熒光響應，而且采用其衍生獲得的檢測結果較為理想［12］。生物胺標準品及葡萄酒樣品的高效液相色譜圖如圖1所示。

由圖1A可知，8種生物胺混標組分在30 min內得到了一個很好的分離效果，其出峰順序為精胺4.50 min，色胺14.84 min，苯乙胺17.83 min，腐胺20.41 min，尸胺22.74min，組胺25.68min，酪胺27.69min，亞精胺28.36 min。由圖1B可知，葡萄酒樣品中生物胺組分出峰順序為精胺4.50 min，色胺13.80 min，苯乙胺18.09 min，腐胺20.42 min，尸胺22.82 min，組胺25.71 min，酪胺27.69 min，亞精胺28.36 min。

圖1　8種生物胺標準品（A）及葡萄酒樣品（B）的高效液相檢測色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of eight biogenic amines standard substance（A）and wine sample（B）

2.2不同地區(qū)葡萄酒中生物胺總量的測定

分別吸取上述標準系列和試樣的衍生溶液注入高效液相色譜儀中，測定，記錄色譜圖，計算各生物胺和內標的峰面積比，以標準系列溶液的質量濃度為縱坐標，以各生物胺和內標的峰面積比為橫坐標，繪制標準曲線，按照標準曲線回歸方程再計算試樣中的生物胺含量，結果如圖2所示。

圖2　新疆不同地區(qū)葡萄酒中生物胺總含量Fig.2 Total contents of biogenic amines in wine from Xinjiang different regions

由圖2可知，不同地區(qū)葡萄酒中生物胺含量存在明顯差異，樣品葡萄酒中生物胺含量在37～327 mg/L范圍，伊犁不同地區(qū)總生物胺含量相對均勻，吐魯番地區(qū)的總生物胺含量相比其他地區(qū)較高，昌吉兩地的生物胺含量相差較大，其他地區(qū)總生物胺含量也存在明顯差異，說明生物胺的生成是一個復雜的過程，在葡萄酒的發(fā)酵過程中與酵母菌及乳酸菌的作用有很大關系且葡萄酒中氨基酸含量、發(fā)酵工藝以及發(fā)酵車間衛(wèi)生條件等都影響著葡萄酒中氨基酸向生物胺及高級醇的轉化，葡萄酒在釀造時加入氨基酸的也會影響生物胺的生成。

2.3各地區(qū)不同生物胺組分含量的測定

新疆不同地區(qū)葡萄酒中精胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、組胺、色胺、腐胺含量測定結果如圖3所示。

圖3　新疆不同地區(qū)葡萄酒中各生物胺組分含量Fig.3 Component contents of biogenic amines in Xinjiang different regions

由圖3可知，新疆不同地區(qū)葡萄酒中精胺、亞精胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、組胺、色胺、腐胺都有檢出，并且有所差異。葡萄酒中組胺含量波動范圍在2.00～9.74 mg/L，其中大部分地區(qū)組胺含量在平均值4.19 mg/L左右，其中伊犁-2和吐魯番-4號樣品中含量偏高。精胺含量波動范圍在28.63～218.38 mg/L，相比其他生物胺，精胺在葡萄酒樣品中的含量最高，說明精胺是葡萄酒發(fā)酵后的主要生物胺，其前體物質是精氨酸［13-16］。亞精胺波動范圍在0.88～4.17 mg/L，其中最高和最低的兩地區(qū)亞精胺含量相差3.29 mg/L，由于亞精胺含量不高，且各地區(qū)相差也不是很大，說明現(xiàn)有的亞精胺控制技術已經很成熟。酪胺波動范圍在1.71～7.24 mg/L，酪胺含量除個別地區(qū)高于平均值外，其他地區(qū)酪胺含量在3.00 mg/L左右。苯乙胺含量波動范圍0.69～4.50 mg/L，吐魯番地區(qū)苯乙胺的含量相對較均勻，阜康和哈密地區(qū)的苯乙胺含量存在明顯差異，可能是加工過程中某些工藝或處理不相同造成的。尸胺除了阜-1沒有檢出外，其他地區(qū)都有檢出，其含量波動范圍在0.02～2.32mg/L，相比其他生物胺而言，尸胺是葡萄酒樣品中含量是最少的生物胺。色胺含量波動范圍在0.41～6.14 mg/L，其中瑪納斯地區(qū)的色胺含量遠遠高于其他地區(qū)的。腐胺含量波動范圍在0.07～83.13 mg/L，其波動范圍比較大，說明腐胺是可以在生產過程中加以控制并減少的生物胺。

3　結論

本實驗按照國標GB/T 5009.208—2008《食品中生物胺含量的測定》中方法測定了20個地區(qū)市售葡萄酒中的生物胺含量，發(fā)現(xiàn)不同產區(qū)的總生物胺存在明顯差異，即使是同一產區(qū)葡萄酒中生物胺含量也可能存在較大的差異，說明在釀酒過程中生物胺的產生很復雜的，同時發(fā)現(xiàn)一些產區(qū)中的生物胺含量較低，說明可以對葡萄酒的一些生產工藝加以調控，來減少葡萄酒中的生物胺含量，以此來降低生物胺對人體的危害。

［1］熊正河.中國葡萄酒標準制定與實施［J］.中國衛(wèi)生標準管理，2011，2（6）：42-47.

［2］張春暉，夏雙梅，張軍翔.葡萄酒中的生物胺的生產與工藝控制［J］.食品科學，2002，23（10）：128-130.

［3］孔維府，范春艷，張翛翰，等.論葡萄酒中生物胺生成的影響因素及其檢測方法［J］.中國釀造，2010，29（6）：13-16.

［4］SOUFLEROS E，BARRIOS M L，BERTRAND A.Correlation between the content of biogenic amines and other wine compounds［J］.Am J Enol Viticult，1998，49（3）：266-278.

［5］李志軍，吳永寧，薛長湖.生物胺與食品安全［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（10）：84-91

［6］劉景，任婧，孫克杰.食品中生物胺的安全性研究進展［J］.食品科學，2013，34（5）：322-326.

［7］LAURA M，NATALIJA N.Histamine and histamine intolerance［J］.Clin Nutr，2007，85（5）：1185-1196.

［8］李志軍，吳永寧，薛長湖.生物胺與食品安全［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（10）：84-91.

［9］RUSSO P，SPANO G，ARENA M P，et al.Are consumers aware of the risks related to biogenic amines in food［C］//Current Research，Technologyand Education Topicsin Applied Microbiologyand Microbial Biotechnology，Spain：Microbiology Series，2010：1087-1095.

［10］欒同青.黃酒釀造過程生物胺變化規(guī)律及其產生菌株研究［D］.濟南：齊魯工業(yè)大學，2013.

［11］范春艷，孔維府，潘秋紅，等.葡萄酒中8種生物胺的RP-HPLC檢測方法的研究［J］.中國釀造，2010，29（3）：168-171.

［12］沈念原，王秀芹.高效液相色譜法測定葡萄酒中生物胺的含量［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（4）：394-396.

［13］李志軍.食品中生物胺及其產生菌株檢測方法研究［D］.青島：中國海洋大學，2007.

［14］李華，梁新紅，郭安鵲.葡萄酒蘋果酸-乳酸菌精氨酸代謝研究概況［J］.微生物學報，2006，46（4）：663-667.

［15］LONVAUD F A.Biogenic amines in wines：role of lactic acid bacteria［J］.FEMS Microbiol Lett，2001，199（11）：9-13.

［16］LEHTONEN P.Determination of amines and amino acids in wine-a review［J］.Am J Enol Viticult，1996，47（2）：127-133.

Determination of eight kinds of biogenic amines content in wine from Xinjiang different regions

DENG Yujie，MA Xuelei，ZHANG Kaiting，WANG Rui，WU Yun，ZHANG Zhenzhen*
（College of Food Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830000，China）

Using dansyl chloride as pre-column derivation agents，eight kinds of biogenic amines content in wine from 21 regions in Xinjiang was determined by reverse phase high phase liquid chromatography（RP-HPLC）.The results showed that the total content of biogenic amines in wine from differentregionswassignificantdifference.Thetotalcontentofbiogenicaminesin wine fromHotan region wasthe least（37.16 mg/L），and the totalcontent of biogenic amines in wine from Turpan region was the highest（335.18 mg/L）.The types of biogenic amines in wine from different regions were also difference.Spermine content was the highest in biogenic amines，and the average content was 87.37 mg/L.By determination and analysis of biogenic amines content，it could provide the basis for safety and quality of biogenic amines in wine of Xinjiang regions.

wine；different region；biogenic amines；determination

N34

0254-5071（2016）07-0171-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.037

2016-04-06

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱濏椖浚╔JEDU2014S019）；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510758006）

鄧玉杰（1991-），女，本科生，研究方向為食品質量與安全。

張珍珍（1984-），女，副教授，博士，研究方向為食品質量與安全。