李　燕,李思雪,王立軒,劉　敏,王亞萍,馬慧娟

1)河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院血管外科 石家莊 050017　2)河北醫(yī)科大學2011級七年制臨床醫(yī)學班 石家莊 050017　3)河北醫(yī)科大學組織胚胎學教研室 石家莊 050017　4)河北醫(yī)科大學生理學教研室 石家莊 050017　5)河北省實驗動物重點實驗室 石家莊 050017

?

慢性間歇性低壓低氧對大鼠離體肺動脈環(huán)舒張功能的影響*

李燕1),李思雪2),王立軒3),劉敏4),王亞萍4),馬慧娟4，5)#

1)河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院血管外科 石家莊 0500172)河北醫(yī)科大學2011級七年制臨床醫(yī)學班 石家莊 0500173)河北醫(yī)科大學組織胚胎學教研室 石家莊 0500174)河北醫(yī)科大學生理學教研室 石家莊 0500175)河北省實驗動物重點實驗室 石家莊 050017

慢性間歇性低壓低氧；血管舒張；eNOS；PI3K；大鼠

目的：探討慢性間歇性低壓低氧(CIHH)對大鼠離體肺動脈環(huán)舒張功能的影響及其機制。方法：成年雄性SD大鼠隨機分為對照組、CIHH組、對照+阻斷劑組和CIHH+阻斷劑組。CIHH大鼠給予每天6 h模擬海拔5 000 m的低壓低氧處理，對照置于常壓常氧環(huán)境同期飼養(yǎng)，28 d后處死大鼠，制備肺動脈環(huán)，加阻斷劑組給予終濃度為10 μmol/L MEK特異性阻斷劑PD98059或PI3K阻斷劑LY294002處理20 min。采用灌流實驗記錄乙酰膽堿誘導的肺動脈的舒張活動;應用Western blot法檢測肺動脈組織中eNOS的表達水平。結(jié)果：CIHH處理可增強乙酰膽堿引起的肺動脈舒張，提高肺動脈組織中eNOS的表達(P<0.05)；PD98059共孵育對CIHH的作用無影響(P>0.05),LY294002共孵育可部分阻斷CIHH的作用(P<0.05)。結(jié)論：CIHH處理可能通過PI3K途徑活化血管內(nèi)皮eNOS，增強乙酰膽堿誘導的大鼠肺動脈舒張。

近年大量研究[1-2]顯示，慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia, CIHH)對機體具有多種有益作用，如：對抗心臟缺血/再灌注損傷、抗心律失常、改善冠心病患者的血脂異常等；并且可以產(chǎn)生神經(jīng)、肝臟保護作用。CIHH具有對機體不利影響小、經(jīng)濟、簡便、安全等優(yōu)點，已被臨床用作非藥物性輔助治療措施[3]。肺動脈在維持肺循環(huán)和正常心臟功能中起著至關重要的作用。肺動脈高壓可以引起肺血管阻力增加，出現(xiàn)肺水腫和右心室肥厚，最終引起右心衰竭[4]。有研究[5]報道，CIHH具有抗高血壓作用，可明顯降低自發(fā)性高血壓大鼠的動脈血壓。研究[6-7]還證實CIHH對大鼠的基礎動脈血壓無影響，但可以對抗病理性動脈血壓變化，并能異化壓力感受性反射。血管平滑肌的舒縮活動在動脈血壓的形成和維持中發(fā)揮重要作用。一氧化氮(nitric oxide，NO)是血管內(nèi)皮細胞分泌的內(nèi)皮衍生舒張因子，是心血管系統(tǒng)重要的生理性調(diào)節(jié)因子。該研究通過離體血管環(huán)灌流實驗，觀察CIHH 對大鼠肺動脈環(huán)舒張功能的影響，并探討其可能的NO相關作用機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)、PI3K阻斷劑LY294002、MEK特異性阻斷劑PD98059均購自美國Sigma公司。PE和ACh溶于水。LY294002、PD98059溶于DMSO。eNOS抗體、PI3K抗體購自美國Abcam公司。GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2實驗動物及分組健康雄性SD大鼠，體重250～320 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，隨機分為對照組、CIHH組、對照+阻斷劑組和CIHH+阻斷劑組,每組12只。CIHH大鼠置于低壓氧艙，給予模擬海拔5 000 m高原(大氣壓為53.732 kPa，氧分壓為11.172 kPa)的低壓低氧處理，每天6 h，其余時間處于常氧環(huán)境。未行CIHH處理的大鼠置于常壓常氧環(huán)境同期飼養(yǎng)。動物自由攝取食物和水。28 d后大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，迅速開肺，取肺動脈，置于盛有冰K-H 液的培養(yǎng)皿內(nèi)，去除血管周圍組織，將肺動脈剪成長3～4 mm的動脈環(huán)備用。K-H液成分(mmol/L)：NaCl 118.0、KCl 4.7、CaCl22.5、MgSO41.2、NaHCO325.0、KH2PO41.2、葡萄糖11.0，pH 7.4。將直徑約0.1 mm的不銹鋼三角形環(huán)鉤小心穿入上述制備的肺動脈環(huán)，置于盛有5 mL K-H液的恒溫(37 ℃)浴槽內(nèi)，持續(xù)通入體積分數(shù)95% O2和5%CO2的混合氣體。動脈環(huán)通過不銹鋼絲和細線與張力換能器連接，用BL-420E+生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)記錄張力，平衡20 min后，調(diào)節(jié)血管基礎張力至5.8×10-3N后，加阻斷劑組給予終濃度為10 μmol/L PD98059[8]或LY294002[9]處理20 min，然后進行1.3中實驗。

1.3ACh誘導的離體肺動脈環(huán)舒張功能的測定上述各組大鼠肺動脈環(huán)預先給予10-6mol/L PE誘發(fā)血管環(huán)的最大收縮，后以累加給藥法給予ACh(10-9～10-5mol/L)，記錄血管舒張曲線。以舒張幅度占最大收縮幅度的百分比表示血管舒張狀態(tài)。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。采用析因設計的方差分析觀察CIHH和阻斷劑處理對大鼠肺動脈eNOS蛋白表達的影響，檢驗水準α=0.05。

2　結(jié)果

2.1CIHH和PD98059處理對離體肺動脈環(huán)舒張功能的影響結(jié)果見圖1，由圖1可知，CIHH可增強ACh引起的肺動脈舒張，PD98059不影響各組大鼠肺動脈的舒張效應。

2.2CIHH和PD98059處理對肺動脈組織中eNOS蛋白表達的影響結(jié)果見圖2、表1。

2.3CIHH和LY294002處理對離體肺動脈環(huán)舒張功能的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，CIHH可增強ACh引起的肺動脈舒張，LY294002孵育可以阻斷CIHH對肺動脈的舒張效應。

圖1　CIHH和PD98059處理對離體肺動脈環(huán)舒張功能的影響

1：對照組；2：CIHH組；3：對照+阻斷劑組；4：CIHH+阻斷劑組。圖2　CIHH和PD98059處理對肺動脈組織中eNOS蛋白表達的影響

表1　CIHH和PD98059處理對肺動脈組織中eNOS蛋白表達的影響(n=6)

FCIHH=85.056，P<0.001；FPD98059<0.001，P>0.999；F交互=0.549，P=0.467。

圖3　CIHH和LY294002處理對離體肺動脈環(huán)舒張功能的影響

2.4CIHH和LY294002處理對肺動脈組織中eNOS表達的影響見圖4、表2。

1：對照組；2：CIHH組；3：對照+阻斷劑組；4：CIHH+阻斷劑組。圖4　CIHH和LY294002處理對肺動脈組織中eNOS表達的影響

表2　CIHH和LY294002處理對肺動脈組織中eNOS表達的影響(n=6)

FCIHH=94.388，P<0.001；FLY294002=23.538，P<0.001；F交互=8.140，P<0.001。

3　討論

CIHH對人體的有益作用逐漸引起關注，而其抗高血壓作用也越來越引起人們的重視[5]。該研究結(jié)果顯示，與對照組相比，CIHH組大鼠肺動脈舒張功能增強，證明CIHH可以增強ACh誘導的肺動脈的舒張功能。

NO是血管內(nèi)皮細胞分泌的一種內(nèi)皮衍生舒張因子,是心血管系統(tǒng)重要的生理性調(diào)節(jié)因子。NO可以激活血管平滑肌細胞的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，導致胞內(nèi)cGMP水平升高，再通過經(jīng)典的cGMP途徑使蛋白激酶活化，進而引發(fā)血管舒張[10]，降低血管張力。有研究[11]表明，eNOS可降低肺動脈高壓，延緩肺動脈高壓的發(fā)展和肺血管的重塑。該研究結(jié)果證實CIHH處理后，大鼠肺動脈中eNOS的表達明顯增強，提示CIHH可以通過激活eNOS，提高局部組織中NO的水平，增強肺血管的舒張功能。

組織中存在不同的分子途徑可以活化eNOS，如：MEK途徑、PI3K途徑、cAMP/PKA途徑等[12]。為了進一步明確CIHH激活eNOS的分子機制，作者應用MEK特異性阻斷劑PD98059孵育肺動脈，結(jié)果顯示PD98059不影響CIHH的作用，提示CIHH激活的eNOS可能不依賴MEK途徑。

PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，作為一種重要的信號酶，可以通過酪氨酸激酶受體途徑和G-蛋白偶聯(lián)受體途徑活化Akt[13]。研究[14]顯示內(nèi)皮細胞中的Akt能夠促進eNOS的磷酸化并增加 NO的含量，提高 NO 的活性及增加 eNOS mRNA 的穩(wěn)定性。該研究結(jié)果顯示，CIHH處理后，大鼠肺動脈eNOS蛋白的表達增加；PI3K特異性阻斷劑LY294002孵育可以阻斷CIHH的舒血管效應，并明顯抑制CIHH大鼠肺動脈組織中eNOS的表達。這些結(jié)果證實了CIHH處理可通過PI3K途徑增強大鼠肺動脈eNOS的表達，提高組織中NO水平，進而引起肺動脈舒張。

綜上所述，該研究證實CIHH可顯著增強ACh誘導的大鼠肺動脈舒張效應，該作用可能與PI3K途徑激活、增加肺動脈中eNOS的表達，進而提高血管中NO的水平有關。

[1]ZHANG Y,YANG HT,ZHOU ZN.The cardioprotection of intermittent hypoxic adaptation[J].Sheng Li Xue Bao,2007,59(5):601

[2]ZHU XH,YAN HC,ZHANG J,et al.Intermittent hypoxia promotes hippocampal neurogenesis and produces antidepressant-like effects in adult rats[J].J Neurosci,2010,30(38):12653

[3]SEREBROVSKAYA TV,NOSAR VI,BRATUS LV,et al.Tissue oxygenation and mitochondrial respiration under different modes of intermittent hypoxia[J].High Alt Med Biol,2013,14(3):280

[4]胡瑩,焦海霞,王瑞幸,等.三七皂苷R1對肺高壓大鼠模型肺動脈的舒張作用[J].中國藥理學通報,2013,29(11):1572

[5]MANUKHINA EB,SMIRIN BV,LYAMINA NP,et al.Role of nitric oxide in adaptation to hypoxia and adaptive defense[J].Physiol Res,2000,49(1):89

[6] ZHANG Y,ZHONG N,GIA J,et al.Effects of chronic intermittent hypoxia on the hemodynamics of systemic circulation in rats[J].Jpn J Physiol,2004,54(2):171

[7] XU P,CAO XB,GAO L,et al.Inhibition of carotid sinus baroreflex in neonatal rats exposed to chronic intermittent hypobaric hypoxia[J].Chin J Physiol,2014,57(6):343

[8]NING WH,ZHAO K.Propionyl-L-carnitine induces eNOS activation and nitric oxide synthesis in endothelial cells via PI3 and Akt kinases[J].Vascul Pharmacol,2013,59(3/4):76

[9]SCHMIDT K,GIBRAEIL HD,MAYER B.Lack of involvement of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in the agonist-induced endothelial nitric oxide synthesis[J].Biochem Pharmacol,2002,63(6):1137

[10]GOULOPOULOU S,HANNAN JL,MATSUMOTO T,et al.Reduced vascular responses to soluble guanylyl cyclase but increased sensitivity to sildenafil in female rats with type 2 diabetes[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2015,309(2):H297

[11]馮曉麗,朱曉波,陳歐,等.腺病毒介導eNOS轉(zhuǎn)染高肺血流肺動脈高壓大鼠模型的研究[J].山東大學學報(醫(yī)學版),2010,48(1):70

[12] LIU H,WANG L,MA H,et al.Coumestrol inhibits carotid sinus baroreceptor activity by cAMP/PKA dependent nitric oxide release in anesthetized male rats[J].Biochem Pharmacol,2015,93(1):42

[13]WEIGERT C,BRODBECK K,KLOPFER K,et al.Angiotensin Ⅱ induces human TGF-beta 1 promoter activation: similarity to hyperglycaemia[J].Diabetologia,2002,45(6):890

[14]KIMMOUN A,LOUIS H,AL KATTANI N,et al.β1-adrenergic inhibition improves cardiac and vascular function in experimental septic shock[J].Crit Care Med,2015,43(9):e332

(2015-11-02收稿責任編輯徐春燕)

Effects of chronic intermittent hypobaric hypoxia on pulmonary vasodilatation of rats

LIYan1),LISixue2),WANGLixuan3),LIUMin4),WANGYaping4),MAHuijuan4,5)

1)DepartmentofVascularSurgery,theSecondHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang0500172)ClassofSeven-YearClinicalMedicineRegisteredin2011，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang0500173)DepartmentofHistologyandEmbryology，HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang0500174)DepartmentofPhysiology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang0500175)HebeiKeyLaboratoryofExperimentalAnimal,Shijiazhuang050017

chronic intermittent hypobaric hypoxia;vasodilatation;eNOS;PI3K;rat

Aim: To investigate the effects of chronic intermittent hypobaric hypoxia(CIHH)on the vasodilatation of isolated pulmonary artery in rats and the underlying mechanism. Methods: Adult male SD rats were randomly allocated into 4 groups: control group, CIHH group, control+blocking agent group and CIHH+blocking agent group. The rats in CIHH groups were exposed to hypoxia simulating 5000 m high altitude in a hypobaric chamber for 28 d, 6 h each day. The rats in control group were maintained in a normoxic environment for a corresponding period. The rats in groups treated with blocking agent were given 10 μmol/L MEK inhibitor PD98059 or PI3K inhibitor LY294002 for 20 min.The vasodilatation of pulmonary artery was recorded by using organ bath technique. The protein expression level of eNOS in pulmonary artery tissue was measured by Western blot. Results: CIHH could remarkably augment the acetylcholine(ACh) induced vasodilatation of pulmonary artery and increase the expression of eNOS in pulmonary artery tissue(P<0.05). Incubated with PD98059 did not affect the effects of CIHH on pulmonary artery. Incubation of LY294002 blocked the effects of CIHH(P<0.05). Conclusion: The data demonstrate that CIHH treatment may enhance ACh induced vasodilatation of pulmonary artery by activating eNOS via PI3K pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.008

*國家自然科學基金資助31100832；河北省自然科學基金資助C2013206183，C2013206174；國家級大學生創(chuàng)新實驗資助項目201310089004

，女，1973年11月生，博士，副教授，研究方向：心血管生理學，E-mail:ankang006@126.com

Q463