鐘　超　任　峻　何納新　孫　娜　顧優(yōu)飛　韓秀群

·流行病學(xué)調(diào)查·

女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分析

鐘超任峻何納新孫娜顧優(yōu)飛韓秀群

目的 研究女性5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）C677T、A1298C和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）A66G三個(gè)位點(diǎn)基因型分布特征。方法 用Taqman-MGB探針檢測(cè)513例育齡女性MTHFR的C677T、A1298C位點(diǎn)和MTRR的A66G位點(diǎn)的基因序列，統(tǒng)計(jì)分析三個(gè)位點(diǎn)的基因多態(tài)性分布特征并與已研究報(bào)道的其他省份進(jìn)行比較。結(jié)果 女性MTHFR C677T純合突變基因型TT的頻率為14.8%，高于海南省與廣東省，低于山東省與河南省，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MTHFR A1298C純合突變基因型CC的頻率為6.6%，高于山東省與河南省。MTRR A66G純合突變基因型GG的頻率為5.7%，與海南省相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.036），與山東、河南及廣東相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 女性MTHFR與MTRR基因多態(tài)性分布特征不同于其他省份，檢測(cè)其多態(tài)性可為制定育齡女性葉酸增補(bǔ)方案提供依據(jù)。

亞甲基四氫葉酸還原酶 甲硫氨酸合成酶還原酶 基因多態(tài)性

葉酸是水溶性B族維生素，在DNA合成、修復(fù)及甲基化的過程中發(fā)揮重要的作用。有研究表明，葉酸缺乏會(huì)導(dǎo)致DNA甲基化異常、DNA鏈斷裂、染色體重組異常［1～3］。參與葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的關(guān)鍵酶包括5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）和甲硫氨酸合成酶還原酶（MTRR）。MTHFR與MTRR等基因的突變所引起的酶活性降低會(huì)導(dǎo)致血液中同型半胱氨酸（Hcy）的水平升高。有研究表明，Hcy水平升高與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、妊娠高血壓等孕期疾病以及神經(jīng)管缺陷（NTDs）、唇腭裂、先天性心臟病等出生缺陷密切相關(guān)［4～8］。本研究中檢測(cè)浙江省舟山市孕齡女性MTHFR和MTRR的三個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)。報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取浙江省舟山市普陀人民醫(yī)院2013年2月至2014年8月進(jìn)行孕前或孕期檢查的女性為觀察對(duì)象，選擇標(biāo)準(zhǔn)為同意采取靜脈血并且進(jìn)行葉酸代謝相關(guān)基因遺傳檢測(cè)的人群。共獲取有效樣本513例，年齡16～44歲。

1.2方法 每名觀察對(duì)象采取EDTA抗凝靜脈血5ml，用血液基因組DNA提取試劑盒（上海萊楓生物技術(shù)有限公司）提取DNA，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。緩沖液TE溶解DNA，選取OD260/OD280值介于1.8～2.0之間者進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶清晰且條帶＞23kb的基因組DNA作為實(shí)驗(yàn)樣品。采用Taqman-MGB技術(shù)檢測(cè)葉酸代謝相關(guān)的三個(gè)基因位點(diǎn)（MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G）的基因型。PCR儀以及試劑均購自Applied Biosystems（ABI）公司。PCR反應(yīng)體系為10μl，包括2×Taqman Universal Master Mix 5μl，20×Taqman-MGB探針0.5μl，去離子水3.5μl以及濃度為20ng/μl的DNA模板1μl。用ABI 9700 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件是95℃ 10min預(yù)變性，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)（92℃ 15s，60℃ 1min），隨后再擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)（89℃ 15s，60℃ 90s），反應(yīng)結(jié)束之后在熒光定量PCR儀（ABI7900）上讀取每個(gè)樣品孔內(nèi)的終點(diǎn)熒光，并利用分析軟件確定每個(gè)樣本的基因分型結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)所研究的舟山市女性人群進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。對(duì)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡的人群進(jìn)行基因型頻率及等位基因頻率統(tǒng)計(jì)，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn) 對(duì)收集到的舟山市女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G三個(gè)位點(diǎn)基因分型統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-weinberg平衡檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果為MTHFR C677T：χ2=0.99，P=0.3197；MTHFR A1298C：χ2=2.92，P=0.0875；MTRR A66G：χ2=1.25，P=0.2636，三組統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），符合Hardy-weinberg平衡，表明本研究所選取的樣本具有區(qū)域代表性。

2.2舟山市女性MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布特征 之前報(bào)道了山東、河南、 四川、海南及廣東女性MTHFR、MTRR基因三個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性分布數(shù)據(jù)［9～11］，采用本研究的舟山市統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與以上地區(qū)的數(shù)據(jù)兩兩進(jìn)行比較，結(jié)果見表1、2。

3　討論

出生缺陷是我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，2012年衛(wèi)生部出生缺陷報(bào)告指出，我國出生缺陷發(fā)生率為5.6%左右，每年新增出生缺陷數(shù)約為90萬例。舟山市2000～2006年出生缺陷率為120.3/萬，這幾年間，先天性心臟病、唇裂有/無唇腭裂及神經(jīng)管畸形等出生缺陷一直位于前6位［12］。有病因?qū)W研究表明，先天性心臟病、唇裂有/無唇腭裂及神經(jīng)管畸形等疾病均與MTHFR和MTRR基因位點(diǎn)多態(tài)性密切相關(guān)［13］。

表1　不同地區(qū)女性MTHFR、MTRR基因型頻數(shù)及頻率分布比較［n（%）］

表2　不同地區(qū)女性MTHFR、MTRR等位基因頻數(shù)及頻率分布比較［n（%）］

本文中，作者對(duì)舟山市育齡女性MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 3個(gè)基因位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行大樣本分析，并與之前報(bào)道的山東省、河南省、四川省、海南省和廣東省的研究數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T、A1298C的基因型頻率和等位基因頻率南北差異明顯。C677T純合突變基因型TT及等位基因T在北方省份（山東省、河南?。┑姆植碱l率比南方省份（舟山市、四川省、海南省、廣東?。└?。與MTHFR C677T基因型分布頻率不同的是，MTHFR A1298C純合突變基因型CC在北方省份的分布頻率則比南方省份低。MTHFR C677T、A1298C和 MTRR A66G三個(gè)基因位點(diǎn)突變可能導(dǎo)致葉酸利用能力下降。臨床研究表明，在葉酸攝入量無顯著差異的情況下，677TT個(gè)體血清葉酸水平比TC、CC型個(gè)體低20 %左右，在血清葉酸濃度低時(shí)，MTHFR 677TT型比CC、CT型Hcy高30 %左右［14］。由于飲食差異，北方人群從日常飲食中攝取的葉酸比南方人群少［15，16］。在飲食差異和遺傳因素共同作用下，北方新生兒出現(xiàn)出生缺陷的幾率可能會(huì)升高。目前國內(nèi)外孕婦葉酸補(bǔ)充劑量一般為0.4mg/d［17］，對(duì)于有葉酸代謝障礙風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，葉酸補(bǔ)充劑量的確定應(yīng)遵循個(gè)性化原則，可根據(jù)MTHFR C677T、A1298C和 MTRR A66G三個(gè)基因位點(diǎn)突變檢測(cè)結(jié)果確定其葉酸增補(bǔ)劑量。了解各地人群的葉酸代謝相關(guān)基因的遺傳分布特征，為各地制定有針對(duì)性的衛(wèi)生政策提供依據(jù)，減少因葉酸缺乏而導(dǎo)致的出生缺陷疾病的發(fā)生，提高人口素質(zhì)［18］。

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316100 浙江省舟山市普陀人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（鐘超 何納新 孫娜 顧優(yōu)飛）

316000 浙江愛易醫(yī)學(xué)科技有限公司舟山醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所

（任峻 韓秀群）