岳陽(yáng)漢族人群HLA-C高分辨等位基因多態(tài)性分析

孫　昂，粟玉萍，代　敏，蘇湘暉，胡　濱，陳　敏（岳陽(yáng)市中心血站，湖南414000）

岳陽(yáng)漢族人群HLA-C高分辨等位基因多態(tài)性分析

孫昂，粟玉萍，代敏，蘇湘暉，胡濱，陳敏（岳陽(yáng)市中心血站，湖南414000）

目的了解岳陽(yáng)漢族人群人類白細(xì)胞抗原-C（HLA-C）高分辨等位基因多態(tài)性及分布特征。方法2014年10月至2015年8月采用基于Illumina Miseq二代測(cè)序技術(shù)對(duì)岳陽(yáng)地區(qū)2 504例造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者HLA-C進(jìn)行高分辨基因分型，直接計(jì)算等位基因頻率，對(duì)其分布規(guī)律進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果2 504例造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者中檢出67個(gè)HLA-C等位基因，其中頻率大于0.050 0的常見等位基因分別為C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01。HLA-C位點(diǎn)基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，觀察值（0.880 2）與期望值（0.876 6）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.214 5）。結(jié)論獲得了岳陽(yáng)地區(qū)漢族人群HLA-C等位基因的分布規(guī)律和特征，為人類學(xué)、移植配型、疾病相關(guān)性等研究提供了參考數(shù)據(jù)。

HLA-C抗原/遺傳學(xué)；等位基因；基因頻率；多態(tài)性，單核苷酸；高分辨基因分型

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因系統(tǒng)根據(jù)編碼分子的分布與功能不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3大類，HLA-C屬Ⅰ類基因。HLA-A、HLA-B、DRB1基因是早期研究的與造血干細(xì)胞移植密切相關(guān)的3個(gè)功能基因，隨著非血緣造血干細(xì)胞移植的增加，HLA-C基因在造血干細(xì)胞移植中的重要性日益受到重視［1］。目前，國(guó)外造血干細(xì)胞移植均對(duì)供患者進(jìn)行HLA-C高分辨基因配型。本研究采用高分辨分型技術(shù)對(duì)岳陽(yáng)地區(qū)2 504例漢族造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者的血液標(biāo)本進(jìn)行HLA-C基因分型，旨在從高分辨水平了解HLA-C基因多態(tài)性及分布特征。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1標(biāo)本來源本研究2 504例血樣全部來自中華骨髓庫(kù)湖南分庫(kù)岳陽(yáng)招募站2014年10月至2015年8月招募的造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者，全部為漢族，岳陽(yáng)本地人，年齡18～45歲，身體狀況符合捐獻(xiàn)者健康征詢要求，留取乙二胺四乙酸抗凝靜脈全血5～8 mL。

1.1.2主要設(shè)備與試劑KAIAO K5500超微量分光光度計(jì)（北京凱奧科技發(fā)展有限公司），TAILONG NP968全自動(dòng)核酸提取純化系統(tǒng)（西安天隆科技有限公司），Miseq高通道測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina），GeneAmp PCR System 9700型擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI），7500 Real Time PCR儀（美國(guó)ABI），DNA提取試劑（西安天隆科技有限公司，批號(hào)：E0814120131），HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DQB1基因二代測(cè)序試劑（荷蘭GenDx公司，批號(hào)：C-15000192）等。

1.2方法使用DNA提取試劑，在全自動(dòng)核酸提取純化系統(tǒng)上提取 DNA，DNA質(zhì)量濃度大于 50 ng/μL，OD260/OD280比值為1.7～1.9。按照二代測(cè)序試劑盒說明書進(jìn)行HLA-C等位基因高分辨檢測(cè)，對(duì)無法確定的基因分型結(jié)果采用Zhou等［2］的方法進(jìn)行精確分型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算等位基因頻率，應(yīng)用Arlerquin3.5軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，P＞0.05為觀察值與期望值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1岳陽(yáng)漢族人群HLA-C基因頻率和分布特征2 504份標(biāo)本中檢出HLA-C等位基因67個(gè)，頻率大于0.050 0的常見等位基因分別為C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01，累計(jì)頻率為0.723 4。2個(gè)以上亞型的HLA-C等位基因11個(gè)，分別為C*01、C*03、C*04、C*05、C*06、C*07、C*08、C*12、C*14、C*15、C*16位點(diǎn)，見表1。

表1　岳陽(yáng)漢族人群HLA-C高分辨等位基因頻率分布

續(xù)表1　岳陽(yáng)漢族人群HLA-C高分辨等位基因頻率分布

2.2Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)HLA-C基因位點(diǎn)觀察值為0.880 2，期望值為0.876 6，觀察值與期望值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.2145），符合Hardy-Weinberg平衡。

3　討　論

HLA是人類最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)，是由一系列緊密連鎖的基因組成的具有高度多態(tài)性的復(fù)合體。1956年開始進(jìn)行HLA分型工作，隨著科技的發(fā)展和研究的深入，HLA分型技術(shù)從最初的血清學(xué)技術(shù)發(fā)展到高分辨DNA測(cè)序技術(shù)，越來越多的HLA等位基因被發(fā)現(xiàn)，截至2016年3月底已確定HLA-Ⅰ類基因10 574個(gè)，其中HLA-C位點(diǎn)2 902個(gè)（數(shù)據(jù)來源于www.ebi.ac.uk/ipd/ imgt/hla/stats.html）。本研究采用基于Illumina Miseq二代測(cè)序技術(shù)（即邊合成邊測(cè)序，在生產(chǎn)新DNA鏈時(shí)加入被熒光標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸，在合成互補(bǔ)鏈時(shí)釋放出熒光信號(hào)，通過捕獲熒光信號(hào)，轉(zhuǎn)化為一個(gè)測(cè)序峰值，獲得互補(bǔ)鏈序列信息，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)后完整讀取核酸序列［3］）對(duì)岳陽(yáng)地區(qū)2 504例漢族造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者進(jìn)行HLA-C基因分型，共檢出67個(gè)HLA-C等位基因，11個(gè)HLA-C等位基因有2個(gè)以上亞型，分別為C*01、C*03、C*04、C*05、C*06、C*07、C*08、C*12、C*14、C*15、C*16位點(diǎn)，表明HLA-C基因具有較高的多態(tài)性；頻率大于 0.050 0的常見等位基因分別為 C*03：03：01、C*03：02：02：01、C*08：01：01、C*03：04：01：02、C*07：02：01：01、C*01：02：01，分別為267例（0.053 3）、304例（0.060 7）、442例（0.088 2）、611例（0.122 0）、934例（0.186 5）、1 065例（0.212 6），占全部HLA-C等位基因的0.723 4。HLA-C基因位點(diǎn)觀察值（0.880 2）與期望值（0.876 6）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.214 5），符合Hardy-Weinberg平衡。

HLA基因多態(tài)性及分布特征與人種、民族及地域有關(guān)，我國(guó)地域廣大，南北地區(qū)漢族人群HLA基因分布存在差異［4］，HLA-C基因也存在差異，C*01：02、C*07：02、C*03：04、C*08：01、C*03：02為中國(guó)漢族人群常見等位基因。岳陽(yáng)漢族人群HLA-C的分布特征與李楨等［5］研究的深圳漢族人群和夏玲等［6］研究的四川漢族人群比較，C*04：01：01：01分布存在差異（深圳漢族人群出現(xiàn)頻率為0.0686，四川漢族人群出現(xiàn)頻率為0.069 7，岳陽(yáng)漢族人群出現(xiàn)頻率為0.043 3），與梁曉嵐等［7］研究的北方漢族人群比較，C*14：02：01分布存在差異（北方漢族人群出現(xiàn)頻率為0.052 6，岳陽(yáng)漢族人群出現(xiàn)頻率為0.0443），可能與研究樣本量大小、基因分型方法不同有關(guān)，也可能是岳陽(yáng)漢族人群HLA-C基因分布具有其自身特點(diǎn)。

HLA-C位點(diǎn)位于人類第6號(hào)染色體短臂的HLA-A、HLA-B位點(diǎn)之間，全長(zhǎng)4.5 kb，其編碼產(chǎn)物屬HLA-Ⅰ類分子，HLA-C位點(diǎn)曾被認(rèn)為不具有多態(tài)性而未被重視，隨著HLA分型技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)，HLA-C與HLA-A、HLA-B基因一樣，具有高度多態(tài)性［8］，其分布于有核細(xì)胞表明其參與了免疫反應(yīng)，HLA-C可與殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）組成KIR/HLA-C信號(hào)傳導(dǎo)通路，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［9］。近年來，有關(guān)HLA-C基因與疾病相關(guān)性的研究不斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)，HLA-C-35 kb C/T與人類免疫缺陷病毒-1感染具有相關(guān)性［10］，HLAC1C1為山東漢族人群梅毒的抗性基因型［11］，HLA-C1基因組表達(dá)水平降低可引起早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)［12］，HLA-C基因相合的造血干細(xì)胞移植急性移植物抗宿主病的發(fā)生明顯降低、存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)［13］。隨著研究的深入，HLA-C基因在個(gè)體抗感染免疫、腫瘤免疫、移植免疫及與疾病發(fā)生的相關(guān)性將逐漸被發(fā)現(xiàn)，對(duì)預(yù)防和早期診斷、治療疾病具有重要意義。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.043

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1009-5519（2016）17-2726-03

2016-05-13）