朱正火, 任育軍, 李燕云, 繆　穎

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

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擬南芥PPRs基因與蓮座葉衰老之間的關(guān)系

朱正火, 任育軍, 李燕云, 繆穎

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)中心，福建 福州 350002)

研究了擬南芥中一個(gè)PPR(稱PPRs)基因與蓮座葉片衰老之間的關(guān)系.實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因在生長(zhǎng)7周的擬南芥各種組織中幾乎都有表達(dá)，在蓮座葉、花序和角果中的表達(dá)較高，在蓮座葉中的表達(dá)隨植株的生長(zhǎng)和衰老進(jìn)程呈不斷下降的趨勢(shì).體外衰老相關(guān)因素處理試驗(yàn)結(jié)果顯示，在4周的蓮座葉中因進(jìn)行離體處理，葉片衰老的程序提前啟動(dòng)，PPRs基因的表達(dá)降至6周時(shí)葉片中的水平，而茉莉酸，冷、熱和干旱處理則延緩了PPRs表達(dá)水平的降低.通過(guò)鑒定獲得PPRs的超表達(dá)和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)植株的蓮座葉衰老表型進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)和反義抑制植株葉片的衰老進(jìn)程與野生型相比并無(wú)太大差別，但在茉莉酸處理后PPRs超表達(dá)植株表現(xiàn)出延遲衰老的表型.在超表達(dá)植株中檢測(cè)一些與葉片衰老相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與野生型相比有些基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯變化.以上結(jié)果表明這個(gè)PPRs基因在擬南芥中可能在某種程度上參與了一些外源因素誘導(dǎo)下加速生長(zhǎng)期擬南芥蓮座葉片衰老進(jìn)程的負(fù)調(diào)節(jié).

PPR基因; 葉片衰老; 擬南芥; 超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株

PPR(pentatricopeptide repeats)蛋白又稱三角狀五肽重復(fù)蛋白，是陸生植物中最龐大的蛋白家族之一，在大多數(shù)植物的基因組中一般包含超過(guò)400個(gè)以上編碼PPR蛋白的基因[1].在過(guò)去的幾十年中，隨著分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步和普及，研究者對(duì)植物中PPR基因家族的數(shù)量和它們編碼的蛋白在植物細(xì)胞中所發(fā)揮的分子功能以及所參與的生理過(guò)程知道的越來(lái)越多[2-3].目前大部分的研究顯示典型的PPR蛋白主要定位于植物細(xì)胞的線粒體或是葉綠體中，通過(guò)結(jié)合到一個(gè)或是幾個(gè)線粒體或葉綠體基因組編碼的轉(zhuǎn)錄本上，對(duì)這些轉(zhuǎn)錄本RNA序列的剪切、轉(zhuǎn)移、加工和翻譯等過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，最終影響這些轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)和功能[1].這些共同的調(diào)控作用對(duì)于線粒體和葉綠體的生成以及功能的發(fā)揮都有著深遠(yuǎn)的影響，并最終影響植物的光合作用、呼吸作用、胚胎發(fā)生、植株生長(zhǎng)以及對(duì)周圍環(huán)境的脅迫和響應(yīng)等[1,4-5].葉片衰老是植物生長(zhǎng)發(fā)育和死亡的必然過(guò)程，對(duì)植物的生長(zhǎng)、瓜果蔬菜等器官的形成以及糧食作物等品質(zhì)和產(chǎn)量的最終構(gòu)成都有著重要的影響[6].研究顯示葉片衰老不僅受到植物內(nèi)在基因的調(diào)控，也受到內(nèi)外環(huán)境因素的誘導(dǎo)[7-8].而線粒體和葉綠體作為植物葉片感受逆境信號(hào)的重要細(xì)胞器在植物感受環(huán)境變化的逆向信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能[9-10].研究發(fā)現(xiàn)很多與葉綠體和線粒體功能相關(guān)的基因已經(jīng)被證明參與了對(duì)葉片衰老的調(diào)控，如單鏈DNA結(jié)合蛋白Whirly家族以及其它定位于線粒體或葉綠體中的核基因組編碼的轉(zhuǎn)錄因子等[11-13].本文研究了一個(gè)擬南芥基因組中定位于葉綠體(質(zhì)體)中的PPR(稱為PPRs)基因與蓮座葉片衰老調(diào)控之間的關(guān)系.通過(guò)表達(dá)分析和轉(zhuǎn)基因相關(guān)實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)PPRs基因與蓮座葉片衰老之間存在一定的負(fù)相關(guān)性，表明這個(gè)基因可能在調(diào)控生長(zhǎng)期的擬南芥蓮座葉響應(yīng)外源衰老誘導(dǎo)因素脅迫的過(guò)程中發(fā)揮一定的功能.

1　材料與方法

1.1材料

野生型擬南芥Columbia生態(tài)型(ArabidopsisthalianaCol-0)種植于福建農(nóng)林大學(xué)生科院分子細(xì)胞和系統(tǒng)生物學(xué)中心溫室內(nèi)，溫度22±1 ℃，濕度65%，光照16 h/黑暗8 h，花多多1號(hào)通用肥按照1∶2 000倍稀釋作為營(yíng)養(yǎng)液.在此培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)7周的植株按照根、花序莖、蓮座葉、莖生葉、花序(混合)和角果(混合)進(jìn)行取材，液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?收集生長(zhǎng)4、5、6、7、8、9周的植株的蓮座葉，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?收集生長(zhǎng)4周的蓮座葉的第5、6、7、8片真葉，體外進(jìn)行衰老相關(guān)因素的誘導(dǎo)處理，處理時(shí)間為24 h，處理因素包括：(1)植物激素：150 μmol茉莉酸(JA)、100 μmol水楊酸(SA)、20 μmol脫落酸(ABA)、50 μmol生長(zhǎng)素(IAA)和50 μmol赤霉素(GA3)；(2)脅迫：暗處理、冷處理(4 ℃)、損傷處理、干旱處理、高溫處理(42 ℃)和雙氧水處理，以上材料在處理結(jié)束后快速收集，液氮速凍后置-80 ℃保存.

1.2方法

1.2.1總RNA的抽提和檢測(cè)采用全式金(TransGen)公司生產(chǎn)的TransZolUp總RNA抽提試劑(ET111-01)對(duì)1.1中收集的樣品進(jìn)行總RNA的分離，1.2% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，并在NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)上進(jìn)行濃度測(cè)定.提取的總RNA置-80 ℃保存.

1.2.2cDNA第一鏈的合成采用康為生物公司(CWBIO)生產(chǎn)的HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒(CW2582)對(duì)1.2.1中提取的總RNA先進(jìn)行基因組消化，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成第一鏈cDNA，具體操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書，總RNA的反轉(zhuǎn)量為1 μg.

1.2.3基因的半定量及定量PCR檢測(cè)半定量PCR檢測(cè)參照康為生物公司(CWBIO)生產(chǎn)的2×Es TaqMasterMix(CW0690)PCR擴(kuò)增系統(tǒng)提供的說(shuō)明書進(jìn)行，擬南芥看家基因GAPC作為對(duì)照基因?qū)?.2.2中合成的不同來(lái)源的cDNA進(jìn)行一致化，GAPC基因擴(kuò)增的引物為：F:5′-ACCACTGTCCACTCTATCACTGC-3和R:5′-TGAGGGATGGCAACACTTTCCC-3′，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為25.PPRs基因的檢測(cè)引物為：F:5′-GAGCCAGAGAATCCAGCTCC-3′和R:5′-CGAGTGTAATACCCCGCACA-3′，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為32.擴(kuò)增產(chǎn)物于2.0% TAE瓊脂糖凝膠上檢測(cè)條帶大小和亮度.半定量PCR檢測(cè)每種組織或處理進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

定量PCR檢測(cè)參照康為生物公司(CWBIO)生產(chǎn)的UltraSYBR Mixture (with ROX)試劑(CW0956)提供的說(shuō)明書及其使用條件進(jìn)行，反應(yīng)體積為20 μL，每管加入1 μL的模板cDNA.定量PCR檢測(cè)使用的引物和半定量PCR檢測(cè)時(shí)使用的引物相同.定量PCR反應(yīng)在BIO-RAD CFX Connect定量PCR儀上進(jìn)行，每個(gè)組織或處理進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù).

1.2.4PPR蛋白的亞細(xì)胞定位檢測(cè)利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建好的PPRs-GFP亞細(xì)胞定位載體通過(guò)基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在洋蔥表皮細(xì)胞中檢測(cè)PPRs蛋白的亞細(xì)胞定位.作為參照，同時(shí)檢測(cè)只表達(dá)GFP和另一個(gè)帶質(zhì)體定位信號(hào)的GFP(CTP-GFP)的定位情況.基因槍轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞的具體操作步驟參見(jiàn)文獻(xiàn)[14].

1.2.5PPRs基因超表達(dá)和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株的篩選和鑒定利用0.01%(v/v)的除草劑對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的PPRs基因超表達(dá)(OE-PPRs)和反義抑制(antisense-PPRs,AN-PPRs)轉(zhuǎn)基因植株的T1代進(jìn)行抗性篩選，并對(duì)抗性植株進(jìn)行PPRs表達(dá)水平的鑒定，方法參照1.2.3中半定量及定量PCR檢測(cè)PPRs基因表達(dá)的方法.T1代轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)種植及抗性篩選獲得T2和T3代，最后通過(guò)計(jì)算分離比以及抗性篩選在T3代植株中鑒定出純合體.

1.2.6PPRs基因超表達(dá)和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉片衰老表型的觀察按照1.1中溫室培養(yǎng)擬南芥的方法對(duì)野生型、OE-PPRs和AN-PPRs轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行種植，并在生長(zhǎng)的第4、5、6、7、8周觀察兩種不同PPRs基因型植株蓮座葉生長(zhǎng)和衰老表型的差異，統(tǒng)計(jì)黃綠葉在每種基因型植株蓮座葉中的分布比例[11]，確定PPRs基因的表達(dá)對(duì)蓮座葉衰老表型的影響.

采用1.1中體外處理的方法，利用150 μM JA對(duì)野生型、OE-PPRs和AN-PPRs生長(zhǎng)4周植株的第5、6、7和8片真葉進(jìn)行體外處理3天，觀察PPRs超表達(dá)和反義抑制植株蓮座葉衰老表型與野生型植株的差別.

1.2.7衰老相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)按照1.2.3中檢測(cè)基因表達(dá)的方法檢測(cè)衰老相關(guān)基因在野生型和OE-PPRs植株蓮座葉中的表達(dá)差異，檢測(cè)的基因及其引物為：CAMTA3(F:5′-GGAAGCTCATGAGAGGTTGAAGGC-3′,R:5′-AGCAACCAGTAACTGCGTCTTTG-3′);DLS1(F:5′-TCTATGTCCTCTCCGTTTCCAGTG-3′,R:5′-CCACGAGAGTTTCAGAAGCACCAG-3′);AHK1(F:5′-GCAGATGTTGCAAAGTCACAGTTC-3′,R:5′-TGCCTGTGCGGTCCTAACATAATC-3′);NANC053(F:5′-AACTGGTGTTCACCAAGATGCG-3′,R:5′-TTTAGGTCCGGAGCCACTCTTC-3′);WRKY70(F:5′-TGAGCTCGAACCCAAGATGTTCAG-3′,R:5′-TGCTCTTGGGAGTTTCTGCGTTG-3′);GLN1(F:5′-TTCGCAGCTACCAAAGTGGAAC-3′,R:5′-GTGTACGCATCGCACATGACAAG-3′);ATG5(F:5′-GTGGCTGGACAAGTTAAGACAGC-3′,R:5′-ACTCAACAGGGCGATTAAGGTACG-3′);SAUR34(F:5′-ATGCCTGACCGGAATTCTCAACC-3′,R:5′-ATTAGCTCCACGACGGAGACAC-3′);ATG7(F:5′-ACGTGGTTGCACCTCAGGATTC-3′,R:5′-ACTAAGAGTTCAACGGCGAGAGC-3′);COR78(F:5′-TGGACAAAGCAATGAGCATGAGC-3′,R:5′-TGGACAAAGCAATGAGCATGAGC-3′);COR15B(F:5′-AAGAGTGAGCTCGTCGTCGTTG-3′,R:5′-TCAGAAGCTTTCTTTGTGGCTTCG-3′).

2　結(jié)果和分析

2.1PPRs基因在野生型擬南芥不同組織和器官中的表達(dá)模式

收集野生型擬南芥生長(zhǎng)7周植株的根、花序莖、蓮座葉、莖生葉、花序和角果，檢測(cè)本文中所研究的這個(gè)PPRs基因在這些組織中的表達(dá)特異性.實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示這個(gè)PPRs基因在所有檢測(cè)的組織中都有表達(dá)，在根中的表達(dá)最低，而在蓮座葉、花序和角果中的表達(dá)較高(圖1)，表明這個(gè)PPRs基因在蓮座葉、花序和角果中可能發(fā)揮一定的功能.

2.2PPRs基因在蓮座葉中隨生長(zhǎng)和葉片衰老進(jìn)程表達(dá)量的變化分析

為了進(jìn)一步檢測(cè)這個(gè)PPRs基因的表達(dá)和功能是否與蓮座葉片的衰老存在相關(guān)性，我們檢測(cè)了這個(gè)基因在野生型擬南芥生長(zhǎng)4、5、6、7、8、9周的蓮座葉中的表達(dá)情況.如圖2A所示，4到5周植株的蓮座葉還處在葉片生長(zhǎng)的階段，但在植株由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化到生殖生長(zhǎng)階段后(第5周到第6周)，蓮座葉也開始由生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化為進(jìn)入衰老的階段，并伴隨著植株的開花和角果的生長(zhǎng)和成熟，蓮座葉的衰老狀況越來(lái)越嚴(yán)重(第6周到第9周)，并最終完全干枯和死亡(10周以后).我們檢測(cè)了PPRs基因在植株從第4周到第9周蓮座葉中的表達(dá)情況，定量PCR的結(jié)果顯示PPRs基因在第4周時(shí)的表達(dá)最高，并伴隨著植株的進(jìn)一步生長(zhǎng)以及從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入生殖生長(zhǎng)，PPRs的表達(dá)下降，并在第6周時(shí)達(dá)到最低，然后從第7周開始略微上升并一直維持在低水平的表達(dá)(圖2B).以上結(jié)果顯示PPRs基因的表達(dá)與蓮座葉片的衰老可能存在一定的負(fù)相關(guān)性，這個(gè)基因在蓮座葉片衰老的過(guò)程中可能起負(fù)調(diào)控的作用.

2.3各種衰老相關(guān)因素處理對(duì)蓮座葉中PPRs基因表達(dá)水平的影響

植物衰老除了受到自身遺傳基因的調(diào)控外，還受到植物激素和多種內(nèi)外環(huán)境因素等的誘導(dǎo)和抑制[15].我們通過(guò)體外處理的方式將生長(zhǎng)4周的野生型植株的蓮座葉片置于這些衰老誘導(dǎo)或抑制因素的處理下，24 h后收集處理的葉片并檢測(cè)PPRs基因在這些不同處理?xiàng)l件下表達(dá)量的變化.圖3的結(jié)果顯示，與及時(shí)剪取而未作任何處理的4周蓮座葉片中PPRs的表達(dá)相比(CK 0 h)，即使在對(duì)照試驗(yàn)組中(CK 24 h)，因?yàn)槿~片已剪下24 h，本身已啟動(dòng)了衰老程序，因此PPRs基因的表達(dá)較新鮮葉片而言仍出現(xiàn)降低，接近于自然生長(zhǎng)情況下6周葉片中表達(dá)的水平(圖2B).在此種情況下，我們發(fā)現(xiàn)在植物激素處理組中，茉莉酸的處理可以延緩PPRs基因表達(dá)水平的降低，而其他激素處理的效果則不明顯(圖3A)；在非生物脅迫處理組中，冷、熱和干旱處理可以明顯延緩PPRs基因表達(dá)水平的降低，其中熱處理的延緩作用最為明顯(圖3B).以上結(jié)果表明PPRs基因雖然在4周植株的蓮座葉中表達(dá)水平最高，但一旦葉片開啟了衰老程序(如將其剪下)，PPRs基因的表達(dá)水平即刻降低，而在離體條件下某些因素如JA、冷、熱和干旱處理等則可以延緩PPRs基因表達(dá)水平的降低.以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明PPRs基因表達(dá)水平的降低與葉片從生長(zhǎng)走向衰老之間存在一定的負(fù)相關(guān)性.

2.4PPRs蛋白定位于洋蔥表皮細(xì)胞的質(zhì)體中

前人的研究發(fā)現(xiàn)植物中典型的PPRs蛋白主要定位于細(xì)胞的線粒體或是葉綠體中，并在這些細(xì)胞器中行使特定的功能[1,4].我們對(duì)文中研究的PPRs基因編碼的蛋白在細(xì)胞中的定位情況進(jìn)行了探討，在PPRs蛋白的C端連接綠色熒光蛋白(GFP)并通過(guò)基因槍系統(tǒng)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞(圖4A)，同時(shí)設(shè)置一個(gè)質(zhì)體特異性定位的GFP(CTP-GFP)(圖4B)和一個(gè)不帶特異定位信號(hào)的GFP(圖4C)作為對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)PPRs-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位與質(zhì)體特異性定位的GFP(CTP-GFP)相同，而與不帶特異定位信號(hào)的GFP明顯不同(圖4)，表明這個(gè)PPRs蛋白特異定位于洋蔥表皮細(xì)胞的質(zhì)體中，可能在擬南芥葉肉細(xì)胞的質(zhì)體/葉綠體中發(fā)揮功能.

2.5PPRs超表達(dá)和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及在自然生長(zhǎng)情況下的蓮座葉片衰老狀態(tài)鑒定

為了對(duì)PPRs基因的功能和擬南芥蓮座葉片衰老之間的相關(guān)性有更深入的了解，我們篩選了這個(gè)基因的超表達(dá)(overexpressing,OE-PPRs)和反義抑制(antisense,AN-PPRs)轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)這些植株中PPRs基因的表達(dá)水平進(jìn)行了鑒定.在檢測(cè)的3個(gè)PPRs反義抑制轉(zhuǎn)基因植株中PPRs的表達(dá)水平降低了67倍以上(圖5A)，而在超表達(dá)植株中PPRs的水平上升了190倍以上(圖5B).對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T3代純合體的蓮座葉自然衰老的表型進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在短日照情況下(延長(zhǎng)植株的生長(zhǎng)期便于觀察衰老表型)生長(zhǎng)8周的植株不論是野生型還是轉(zhuǎn)基因都呈現(xiàn)出一定的衰老特征，但是轉(zhuǎn)基因和野生型的蓮座葉之間的衰老狀態(tài)并沒(méi)有顯著的差別(圖5C)，盡管蓮座葉黃綠葉的比例統(tǒng)計(jì)顯示OE-PPRs植株的綠葉比例較野生型和AN-PPRs植株略高一點(diǎn)(圖5D).在AN-PPRs生長(zhǎng)6周植株的蓮座葉中用半定量PCR的方法檢測(cè)了一些與衰老相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)有些基因在AN-PPRs中較野生型相比表達(dá)水平出現(xiàn)一定的增強(qiáng)，如CAMTA3、GLN1、AHK3、ATG5、ANAC053和SUAR34等，使AN-PPRs植株相對(duì)于野生型表現(xiàn)出一定的分子衰老表型，但因?yàn)槌鼵AMTA3、GLN1和AHK3之外其他基因表達(dá)水平的變化不太顯著(圖5E)，因此在視覺(jué)上AN-PPRs植株的葉片衰老表型與野生型并無(wú)太大差別.綜合PPRs基因在野生型蓮座葉中隨生長(zhǎng)和葉片衰老進(jìn)程表達(dá)量的變化情況(圖2)、PPRs轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉片自然衰老的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(圖5C-D)以及一些衰老基因半定量PCR檢測(cè)的結(jié)果(圖5E)，以上的研究表明在6周以后的植株自然衰老情況下，PPRs基因可能并不直接參與對(duì)蓮座葉片衰老的調(diào)節(jié)，或者說(shuō)單獨(dú)的PPRs基因還不足以實(shí)現(xiàn)對(duì)葉片衰老的調(diào)節(jié).

2.6蓮座葉處在生長(zhǎng)期的PPRs超表達(dá)植株對(duì)JA體外誘導(dǎo)的葉片衰老進(jìn)程具有明顯的延遲效應(yīng)

鑒于在自然生長(zhǎng)情況下野生型、OE-PPRs和AN-PPRs植株的蓮座葉并未表現(xiàn)出在衰老進(jìn)程上明顯的差別，我們想知道通過(guò)體外衰老誘導(dǎo)因素處理后植株提前進(jìn)入衰老程序的過(guò)程中3種PPRs不同表達(dá)水平的差異是否對(duì)脅迫因素誘導(dǎo)的衰老產(chǎn)生不同的響應(yīng).為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，我們剪取了自然生長(zhǎng)情況下4周的野生型、OE-PPRs和AN-PPRs植株的第5、6、7和8片蓮座葉，將它們正面朝上漂浮于添加有150 μmol JA的1/2MS培養(yǎng)液中，同時(shí)為了便于比較，還設(shè)置了不添加JA的對(duì)照.以上的處理組和對(duì)照組在正常培養(yǎng)條件下處理3 d，然后觀察葉片的衰老程度.如圖6A所示，在不添加JA的對(duì)照組中，經(jīng)過(guò)3 d的處理，野生型、OE-PPRs和AN-PPRs植株的葉片并未表現(xiàn)出明顯的衰老癥狀，3種不同PPRs表達(dá)背景的葉片之間看不出明顯的差別；而在JA處理組這邊，野生型和AN-PPRs植株的第5-8片蓮座葉都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的衰老表型，但它們之間的衰老狀況看不出明顯的差異，這可能需要設(shè)置更為精細(xì)的JA處理?xiàng)l件才能加以區(qū)分.而在同樣的JA處理?xiàng)l件下，OE-PPRs的葉片在JA處理后相對(duì)于野生型和AN-PPRs表現(xiàn)出明顯的衰老延遲效應(yīng)，而且隨著葉片的幼嫩程度越高(第5至第8)，衰老延遲的效應(yīng)也越明顯.以上結(jié)果說(shuō)明在蓮座葉還處在生長(zhǎng)期的階段(5周以前)，如果有外部因素誘導(dǎo)葉片提前進(jìn)入衰老程序，那么PPRs的高表達(dá)可以幫助葉片延緩進(jìn)入衰老的時(shí)間，而且葉片越幼嫩，其延遲進(jìn)入衰老程序的時(shí)間也將越長(zhǎng).因此，在生長(zhǎng)期的蓮座葉中(5周以前)，PPRs的表達(dá)水平與脅迫誘導(dǎo)的葉片衰老程度之間存在負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與試驗(yàn)2.3中的結(jié)果相一致.

為了弄清PPRs基因超表達(dá)延遲葉片提前進(jìn)入衰老程序的分子機(jī)理，我們?cè)贘A處理后的OE-PPRs和野生型的葉片中檢測(cè)了結(jié)果2.5中所描述的與衰老相關(guān)基因的表達(dá).實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果顯示，在這些被檢測(cè)的基因中，CAMTA3、DLS1、AHK1、NANC053、WRKY70、GLN1、ATG5、SAUR34和ATG7基因在OE-PPRs葉片中的表達(dá)相對(duì)于野生型植株呈顯著性下調(diào)，而COR78和COR15B基因的表達(dá)則正好相反(圖6B)，這些衰老相關(guān)基因表達(dá)水平的變化趨勢(shì)與它們?cè)谝吧椭凶匀凰ダ蠣顟B(tài)下的變化趨勢(shì)是一致的(結(jié)果未展示)，表明它們很可能在OE-PPRs植株中作為調(diào)控的下游基因參與了衰老誘導(dǎo)因素脅迫下對(duì)發(fā)育期葉片提前進(jìn)入衰老程序的調(diào)節(jié).

3　討論

葉片衰老是由多因素控制并協(xié)同調(diào)節(jié)的過(guò)程，除了受到遺傳因素的調(diào)控外，各種內(nèi)外因素的脅迫和誘導(dǎo)都可能促使葉片提前產(chǎn)生衰老表征[6-8]，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和結(jié)實(shí)等過(guò)程產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，最終對(duì)農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行人為調(diào)控[6].為了了解植物在自然衰老和脅迫因素誘導(dǎo)衰老的過(guò)程中所涉及的分子機(jī)理，以往的研究主要通過(guò)突變體分析、大規(guī)模轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方式尋找到了很多可能引發(fā)植物衰老的誘因以及與之相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[16-17]，這些前期工作的積累使我們對(duì)植物衰老的分子調(diào)控已經(jīng)有了一定的認(rèn)識(shí)，也掌握了一定的經(jīng)驗(yàn)來(lái)控制植物衰老的進(jìn)程[18].以前的研究顯示細(xì)胞核作為基因表達(dá)的分子調(diào)控中心在植物感受機(jī)體內(nèi)外衰老信號(hào)的過(guò)程中發(fā)揮著核心作用[6-8,17]，而最新的研究顯示線粒體和葉綠體作為植物細(xì)胞中攜帶遺傳信息的細(xì)胞器在傳遞植物逆境信號(hào)，協(xié)調(diào)細(xì)胞核行使精確調(diào)控功能的過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用[9-10]，而一些定位于線粒體或葉綠體中的蛋白可能在協(xié)調(diào)這些細(xì)胞器的功能方面發(fā)揮作用[9-10].

本文研究了擬南芥中一個(gè)由核基因編碼定位于質(zhì)體/葉綠體中的PPRs蛋白與蓮座葉片衰老調(diào)節(jié)之間的關(guān)系.結(jié)果表明，PPRs基因在蓮座葉中的表達(dá)水平與葉片進(jìn)入衰老程序呈負(fù)相關(guān)(圖2).而在生長(zhǎng)4周的植株中，剪取的蓮座葉在離體24 h后PPRs基因的表達(dá)即降到葉片進(jìn)入衰老程序的水平(圖3)，而JA、冷、熱和干旱處理與對(duì)照相比則可以明顯延緩PPRs表達(dá)水平的降低，這可能與這些因素可以在4周離體的葉片中促進(jìn)PPRs基因的表達(dá)有關(guān)，從而部分抵消了葉片離體后啟動(dòng)衰老程序從而使PPRs基因表達(dá)水平快速降低的效應(yīng)，這也進(jìn)一步說(shuō)明了PPRs基因的表達(dá)水平和葉片進(jìn)入衰老程序呈負(fù)相關(guān).

本研究利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了PPRs基因的超表達(dá)和反義抑制植株(圖5).自然生長(zhǎng)的情況下觀察蓮座葉的衰老表型發(fā)現(xiàn)不論P(yáng)PRs超表達(dá)還是反義抑制植株其葉片衰老的表型與野生型相比沒(méi)有明顯的視覺(jué)上的差異(圖5)，表明PPRs可能并不參與或者不單獨(dú)參與對(duì)自然衰老(6周以后)情況下葉片衰老的調(diào)節(jié).但在JA體外誘導(dǎo)生長(zhǎng)4周植株的葉片提前進(jìn)入衰老程序的過(guò)程中，PPRs超表達(dá)植株表現(xiàn)出明顯的衰老延遲效應(yīng)，表明PPRs可能只在植株早期生長(zhǎng)的過(guò)程中參與抵御外部脅迫因素誘導(dǎo)的葉片衰老調(diào)節(jié)，這一效應(yīng)與分子水平上檢測(cè)的下游衰老相關(guān)基因的表達(dá)變化模式相一致(圖6)，說(shuō)明PPRs很可能是通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)這些外部因素誘導(dǎo)的反應(yīng).但因?yàn)槲覀冄芯康腜PRs蛋白定位于細(xì)胞的質(zhì)體/葉綠體中(圖4)，而我們檢測(cè)到的表達(dá)變化的衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，因此PPRs通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控葉片的衰老進(jìn)程可能并不是通過(guò)典型的PPRs在葉綠體/線粒體中直接與細(xì)胞器基因組編碼的目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合從而調(diào)控它們的剪切、轉(zhuǎn)移、加工和翻譯[1-4]，而很有可能是在葉綠體中通過(guò)調(diào)控某一(或某些)葉綠體基因組編碼基因的表達(dá)，影響這一(些)基因的功能，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞器-細(xì)胞核逆向信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制將葉綠體中形成的應(yīng)激信號(hào)傳遞到細(xì)胞核中，從而啟動(dòng)核基因組中編碼衰老相關(guān)基因的表達(dá)，最終形成整個(gè)植株的葉片對(duì)衰老誘導(dǎo)信號(hào)的響應(yīng).以上的推論將在以后的研究中進(jìn)一步加以論證.

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(責(zé)任編輯:吳顯達(dá))

Relationship between pentatricopeptide repeat genePPRsand rosette leaf senescence inArabidopsis

ZHU Zhenghuo, REN Yujun, LI Yanyun, MIAO Ying

(Center for Molecular Cell and Systems Biology, College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Pentatricopeptide repeats (PPR) play important roles in plant growth, development and dealing with endogenous and exogenous stresses. To elucidate the function of aPPRgene (PPRs) on the regulation of rosette leaf senescence inArabidopsis, real-time qPCR analysis was applied to evaluate the relative transcription level ofPPRsgene in different tissues and organs in 7-week-old wild-typeArabidopsis. Meanwhile, the 4th week old plants were treated with phytohormones, including jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), abscisic acid (ABA), auxin (IAA) and gibberellins (GA3), and abiotic treatments (coldness, hotness, wounding, drought, darkness and H2O2) for 24 hours. Results showed that the relative expression ofPPRsgene was higher in rosette leaves, flowers and siliques than in the other tissues of the wide-type plants, and the relative expression decreased significantly in rosette leaves when their senescence initiated. After being treated with various stresses, the relative expression ofPPRsgene in 4-week-old plants dropped to that of 6-week-old plants compared with the control plants, though JA, coldness, hotness, and drought-treated plants had significantly higher expression ofPPRsgene than other treatments. Phenotypes of rosette leaf at senescence period were almost the same among over-expressing (OE-PPRs), antisense-PPRs(AN-PPRs), and wild-type plants. Nevertheless, leaf senescence of JA-treatedOE-PPRsplants was significantly retarded compared with the wild-type, and it was consistent with variations in the expression of senescence-associated genes betweenOE-PPRsand wild-type plants. This study has provided insight into the negative regulation ofPPRsgene in rosette leaf senescence period.

pentatricopeptide repeats genes; leaf senescence;Arabidopsis; over-expressing transgenic plants

2016-02-14

2016-03-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470383);國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31400260);福建省“百人計(jì)劃”基金.

朱正火(1990-),男.碩士.研究方向：植物細(xì)胞生物學(xué).Email：1286759264@qq.com.通訊作者繆穎(1965-),女,教授,博士生導(dǎo)師.研究方向：植物分子細(xì)胞生物學(xué).Email：ymiao@fafu.edu.cn.

Q291

A

1671-5470(2016)03-0282-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.008