謝勇平, 李宇翔, 張文連, 申愛麗, 李清祿

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)省級(jí)動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建省疾病控制中心，福建 福州 350001)

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楮頭紅皂苷的抑菌效果和抗乙肝病毒活性

謝勇平1,2, 李宇翔3, 張文連1, 申愛麗1, 李清祿1,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)省級(jí)動(dòng)物藥物工程實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建省疾病控制中心，福建 福州 350001)

將楮頭紅醇提取物用正丁醇萃取，萃取物經(jīng)硅膠柱層析和制備型高效液相色譜(PHPLC)純化得一純凈物，通過IR、ESI-MS和13C NMR譜等分析，鑒定為呋甾烷型甾體皂苷，命名為楮頭紅皂苷A(SWSA)，系首次從楮頭紅中提取得到.抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明：SWSA對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、耶爾森氏菌和嗜水氣單胞菌均有較好的抑制效果，其最小抑菌濃度分別為2.8、3.3、2.5和2.2 mg·mL-1；對(duì)大腸埃希氏菌和銅綠假單胞菌的抑制效果不明顯.通過3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試驗(yàn)檢測(cè)SWSA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg和HBeAg的水平，綜合評(píng)價(jià)不同含量SWSA體外抗乙肝病毒(HBV)的活性.結(jié)果表明，SWSA處理 HepG2.2.15細(xì)胞后，HBsAg和HBeAg的表達(dá)均呈時(shí)間和劑量依賴性抑制，治療指數(shù)分別為6.43和4.23，預(yù)示SWSA具有一定的體外抗HBV活性.

楮頭紅; 皂苷; 抑菌活性; HepG2.2.15細(xì)胞; 乙肝病毒

乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是一個(gè)世界性的健康問題，它不僅可以導(dǎo)致急、慢性HBV感染，還與75%～90%的原發(fā)性肝癌相關(guān).目前臨床上用于治療HBV感染的藥物除干擾素外，還有眾多化學(xué)合成藥物，如核苷類似物阿糖腺苷、拉米夫定、泛昔洛韋、阿地福韋和恩他卡韋等.這些藥物已在實(shí)驗(yàn)室和臨床應(yīng)用中被證實(shí)能顯著抑制HBV DNA的復(fù)制或抑制HBsAg和HBeAg的表達(dá)與分泌[1-4].然而這些藥物存在一定的不足，如耐藥性及副作用等，停藥后發(fā)生谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)反跳，甚至發(fā)生重癥肝炎[5]，上述種種不足使得在臨床應(yīng)用上受到極大的限制.隨著天然植物及其提取物抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等有效成分研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)天然藥物具有對(duì)人體低毒副作用和不易產(chǎn)生耐藥性等顯著特點(diǎn).針對(duì)目前病毒性肝炎治療中的困難，尋找與證實(shí)有效天然藥物已經(jīng)成為臨床治療病毒性肝炎的希望與重要手段.傳統(tǒng)中草藥品種繁多，已廣泛應(yīng)用于臨床治療慢性乙型肝炎并取得一定療效[6].

楮頭紅(SarcopyramisnepalensisWall)屬野牡丹科肉穗草屬，主要分布于中國的福建、臺(tái)灣、四川、云南、江西、廣西、廣東、湖北和貴州等地[7].楮頭紅主治肺熱咳嗽和急性肝炎，在福建民間廣泛用于治療急、慢性肝炎，療效顯著[8].藥理活性研究表明，楮頭紅提取物具有多種藥理活性，如正丁醇部位具有較強(qiáng)的保肝護(hù)肝、抗病毒和抑菌作用等活性[9].迄今為止，已從楮頭紅提取分離得到很多具有很好藥理活性的物質(zhì)，如β-谷甾醇、胡蘿卜苷、山柰酚、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、蘆丁、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷[10-11]和多糖[12]等.經(jīng)分離、鑒定，正丁醇部位的主要活性物質(zhì)為皂苷類物質(zhì)，本試驗(yàn)初步探討該皂苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、抗乙肝病毒和抑菌活性，并測(cè)定了其最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)，旨在為楮頭紅藥理活性成分的篩選和臨床應(yīng)用提供參考.

1　材料與方法

1.1材料

楮頭紅皂苷A(S.nepalensissaponin A, SWSA)為褐色粉末，由本實(shí)驗(yàn)室提取分離.

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和耶爾森氏菌(Yersiniavanloghem)由福建農(nóng)林大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供.分別將各菌株接種至裝有5 mL的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中，于37 ℃培養(yǎng)18 h.

HBV DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(HepG2)的2.2.15細(xì)胞系，由美國Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)并保藏，引進(jìn)后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，置5% CO2的培養(yǎng)箱于37 ℃培養(yǎng);培養(yǎng)基為DMEM,在培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清和200 mg·mL-1G418;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司；胰蛋白酶和L-谷氨酰胺購自Amresco公司；G418購自Promega公司；青霉素和鏈霉素購自中國華北制藥廠；二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)購自Sigma公司；HBsAg和HbeAg ELISA檢測(cè)試劑盒購自上?？迫A生物工程公司；拉米夫定購自蘇州葛蘭素史克制藥有限公司，用DMSO適量溶解后，DMEM稀釋配制成試驗(yàn)所需含量，置4 ℃的冰箱保存(臨用前用0.22 μm濾膜過濾)；其他所需化學(xué)試劑均為分析純.

1.2SWSA的制備

楮頭紅全草粉末用95%乙醇于80 ℃回流浸提3次，每次3 h，合并濾液減壓濃縮成浸膏.浸膏用水混懸，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯及水飽和的正丁醇萃取，收集正丁醇層萃取液，減壓濃縮，冷凍干燥得楮頭紅粗皂苷.粗皂苷經(jīng)硅膠柱層析(CCl3∶CH3OH=2∶1)及制備型高效液相色譜(PHPLC)梯度洗脫，收集洗脫液冷凍干燥得褐色粉末樣品.PHPLC條件為：ULtimate XB-C18色譜柱(5 μm，10 mm×250 mm);紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長分別為203和210 nm；流速為2 mL·min-1；溫度為23 ℃；以乙腈與水的混合溶液(8∶92～20∶80)為流動(dòng)相.

1.3SWSA結(jié)構(gòu)的鑒定

樣品經(jīng)紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共振譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征.

1.4SWSA供試液制備

準(zhǔn)確稱取一定量的SWSA，用生理鹽水溶解，過0.22 μm的微孔濾膜，除菌，配制成含量為10 mg·mL-1的皂苷供試液，密封待用.

1.5SWSA抑菌試驗(yàn)

1.5.1抑菌圈試驗(yàn)在無菌操作條件下,用移液槍吸取0.1 mL不同菌液置營養(yǎng)瓊脂平板上，涂布均勻.每個(gè)平板上放3個(gè)蘸有供試液的濾紙片和一個(gè)蘸有慶大霉素(單位為10-4)的濾紙片，做好標(biāo)記.每個(gè)菌液設(shè)3次平行.以在平板上貼有無菌蘸有供試液的濾紙片為空白對(duì)照.置37 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h.

鉆探鉆井孔內(nèi)安全基礎(chǔ)性問題應(yīng)包括孔壁安全和軌跡安全?？妆诎踩橇W(xué)平衡和物化平衡問題，是一個(gè)多場(chǎng)多介質(zhì)(應(yīng)力場(chǎng)、壓力場(chǎng)、溫度場(chǎng)和流體場(chǎng)；流體、巖體、鉆具)條件下的壓力、應(yīng)力和物化等平衡，同時(shí)各平衡相互影響，其中一項(xiàng)不平衡都會(huì)導(dǎo)致孔壁安全問題。鉆孔軌跡安全是空間力學(xué)問題，是鉆孔軌跡空間形態(tài)引起的孔壁與鉆桿柱摩阻力對(duì)起下鉆、鉆進(jìn)和其他孔底作業(yè)的屏蔽作用，可導(dǎo)致鉆進(jìn)過程難以掌控和起下鉆遇卡等問題。

1.5.2MIC的測(cè)定供試液過0.22 μm的微孔濾膜，除菌，采用10倍和2倍稀釋法測(cè)定MIC.

(1)10倍稀釋法：在試管中加入1 mL營養(yǎng)肉湯、0.1 mL稀釋好的菌液和1 mL藥液.陽性對(duì)照只加菌液不加藥液，陰性對(duì)照只加供試液不加菌液.

(2)2倍稀釋法：依據(jù)10倍稀釋法的結(jié)果，進(jìn)一步確定SWSA的MIC.藥液用生理鹽水倍比稀釋，使樣品濃度的梯度分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32.

供試液置37 ℃的恒溫培養(yǎng)振蕩器培養(yǎng)18 h后，肉眼觀察試管中的液體是否渾濁.若試管中的液體透明澄清，表明無菌生長；若試管中的液體渾濁，表明有菌生長.以肉眼所見試管中不渾濁的最低供試液含量為SWSA的MIC.

1.6藥物毒性的測(cè)定

采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT)法測(cè)定藥物毒性.取對(duì)數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞按105個(gè)·mL-1接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1 mL，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中過夜貼壁后，將供試液用完全培養(yǎng)基配制成相應(yīng)含量 (10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 mg·mL-1) 后對(duì)原培養(yǎng)基進(jìn)行置換，每個(gè)含量設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔0.1 mL，同時(shí)設(shè)無藥細(xì)胞對(duì)照和陽性對(duì)照(2 mg·mL-1拉米夫定).加藥后培養(yǎng)4和8 d，棄上清液用MTT染色，每孔加0.1 mL 1 mg·mL-1MTT無血清培養(yǎng)液，孵育4 h，棄上清液，每孔加150 μL DMSO，采用酶標(biāo)儀(波長570 nm)測(cè)定各孔的光密度(D)，試驗(yàn)重復(fù)3次.計(jì)算細(xì)胞的存活率，利用軟件計(jì)算半數(shù)毒性濃度(50% toxicity concentration,TC50).

將上述方法處理的HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行分組試驗(yàn)，在藥物作用2、4、6、8、10和12 d后分別吸取細(xì)胞上清液，按HBsAg和HBeAg檢測(cè)試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的D，并計(jì)算對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率，利用軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50).

治療指數(shù)(therapeutic index,TI)按公式計(jì)算：TI=TC50/IC50.TI>2為有效低毒，1

1.8數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進(jìn)行多因素方差分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果與分析

2.1SWSA的結(jié)構(gòu)

紅外光譜圖顯示，SWSA的特征吸收峰分別為3 378、1 734、1 646、1 409和1 235 cm-1.其中，3 378 cm-1為O-H伸縮振動(dòng)區(qū)，1 734 cm-1為羰基，1 646 cm-1為雙鍵的伸縮振動(dòng).ESI-MS負(fù)離子質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰577(M+-H)，表明本品分子質(zhì)量為578，m/z 445(M+-H-132)為脫掉1個(gè)132質(zhì)量單位糖的碎片.13C NMR譜中C-18、C-19、C-21和C-27的化學(xué)位移分別為18.1、16.8、16.7和17.9，表明化合物為甾體皂苷.C-5和C-6的化學(xué)位移分別為144.4和128.0，表明C-5和C-6有雙鍵.C-12信號(hào)(δ176.2)表明C-12位連有羰基(表1).與薯蕷皂苷元[15]對(duì)應(yīng)的C-26信號(hào)相比， SWSA的C-26化學(xué)位移為73.8，向低場(chǎng)位移，且紅外光譜圖上無螺縮酮特征吸收，可推測(cè)SWSA的皂苷元部分為F環(huán)開環(huán).綜上推斷SWSA為呋甾烷型甾體皂苷，分子式為C32H50O9，其結(jié)構(gòu)為3-O-(β-D-戊糖苷基)-19,23-三醇-12-酮，結(jié)構(gòu)圖如圖1所示.

2.2SWSA的抑菌效果

表2表明：SWSA對(duì)嗜水氣單胞菌、耶爾森氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作用后，產(chǎn)生明顯的抑菌圈；對(duì)大腸埃希氏菌抑制效果不明顯；對(duì)銅綠假單胞菌沒有抑制作用.用10倍和2倍稀釋法逐步確定SWSA對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、耶爾森氏菌和嗜水氣單胞菌的MIC分別為2.8、3.3、2.5和2.2 mg·mL-1.

表1　SWSA的13C NMR譜數(shù)據(jù)

1)濾紙片直徑為6 mm，-表示無抑菌效果.

2.3抗乙肝病毒的效果

2.3.1HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的規(guī)律在試驗(yàn)條件下，供試HepG2.2.15細(xì)胞于第3天開始檢測(cè)到有HBsAg和HBeAg的分泌，在第8天達(dá)到高峰，以后逐漸減弱，持續(xù)到第13天.

2.3.2SWSA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響MTT試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示： 與對(duì)照組相比，拉米夫定陽性對(duì)照組和SWSA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的抑制呈劑量、時(shí)間依賴性 (P<0.05)；與拉米夫定陽性對(duì)照組比較，SWSA的含量為5.0 mg·mL-1時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于拉米夫定,含量為2.5 mg·mL-1時(shí)弱于拉米夫定(P<0.05)(表3).

2.3.3SWSA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg含量的影響HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg含量的檢測(cè)結(jié)果(表4、5)顯示：與對(duì)照組相比，拉米夫定陽性對(duì)照組和SWSA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg和HBeAg兩種抗原的表達(dá)均呈劑量、時(shí)間依賴性抑制；與拉米夫定陽性對(duì)照組比較，SWSA含量為2.5 mg·mL-1時(shí)對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制效果均優(yōu)于拉米夫定.通過對(duì)TI的分析比較，SWSA作用8 d,TI均大于2，呈有效低毒.

表3　SWSA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響1)

1)*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；▲表示與陽性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05).

表4　SWSA在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HBsAg的抑制作用1)

1)*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，▲表示與陽性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；第4和8天的TI分別為1.79和6.43.

表5　SWSA在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HBeAg的抑制作用1)

1)*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，▲表示與陽性對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)；第4和8天的TI分別為1.95和4.23.

3　討論

HepG 2.2.15細(xì)胞模型是1986年Sureau et al[16]利用電穿孔基因轉(zhuǎn)移技術(shù)以重組載體pHoITHBV-1轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2，經(jīng)G418篩選后獲得的可產(chǎn)生高水平表達(dá)HBsAg和HBeAg的細(xì)胞株.HepG 2.2.15細(xì)胞模型可以穩(wěn)定表達(dá)HBV基因，并支持Dane樣顆粒的包裝與分泌，故本試驗(yàn)選取該細(xì)胞模型探討SWSA抗乙肝病毒的作用.

本試驗(yàn)結(jié)果表明，SWSA在設(shè)定的含量范圍內(nèi)與無藥細(xì)胞對(duì)照組相比對(duì)HBsAg和HBeAg有明顯的抑制作用，且隨著SWSA含量的增加，其抑制作用增強(qiáng)，顯示出一定的量效關(guān)系，對(duì)HBsAg和HBeAg的治療有效低毒(TI分別為6.43和4.23).但本試驗(yàn)結(jié)果僅揭示了SWSA在HepG2.2.15這一細(xì)胞模型上對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制作用，而在HBV臨床感染中，受感染肝細(xì)胞HBV DNA的復(fù)制、HBsAg和HBeAg的合成均受到機(jī)體免疫功能狀態(tài)及多種病理狀態(tài)的影響，其變化比體外細(xì)胞水平要復(fù)雜得多.因此，還需結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)確定，其作用機(jī)制也有待于進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

Bacteriostasis and anti-HBV activities of saponins fromSarcopyramisnepalensis

XIE Yongping1,2, LI Yuxiang3, ZHANG Wenlian1, SHEN Aili1, LI Qinglu1,2

(1.College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Provincial Engineering Laboratory of Animal Pharmaceuticals, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 3.Fujian Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou, Fujian 350001, China)

To elucidate the pharmacological properties ofSarcopyramisnepalensisWall for clinical application, steroidal saponin monomer was extracted by n-butyl alcohol and filtered via silica gel column chromatography and preparative high performance liquid chromatography (PHPLC). Molecular structure of the monomer was identified by infrared spectroscopy (IR), electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), and13C nuclear magnetic resonance (NMR), and followed by bacteriostasis and anti-HBV activities tests via filter paper method. The monomer was identified as furostan steroidal saponin and namedS.nepalensissaponin A (SWSA). SWSA had relatively strong bactericidal capacity toStaphylococcusaureus,AeromonashydrophilaandBacillussubtilis, with the minimal inhibitory concentration (MIC) being 2.8, 3.3, 2.5, 2.2 mg·mL-1, respectively. Although, its bactericidal capacity toEscherichiacoliandPseudomonasaeruginosawere relatively weak. Subsequently, anti-HBV activities of SWSA on hepatitis B virus (HBV)invitrowas evaluated by proliferation level of cell line 2.2.15 and the contents of HBsAg and HBeAg via enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results showed the inhibitory effect of SWSA on HBV was both dose and time dependent, with the therapeutic index on HBsAg and HBeAg being 6.43 and 4.23. To summarize, SWSA showed inhibitory efficacy on HBVinvitroto some extent.

Sarcopyramisnepalensis; saponin; antimicrobial activity; HepG2.2.15 cell; hepatitis B virus

2015-06-25

2015-12-09

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013J01360).

謝勇平(1978-)，男，講師.研究方向：天然產(chǎn)物活性成分提取.Email：xypnm@163.com.通訊作者李清祿(1957-)，男，教授.研究方向：天然產(chǎn)物活性成分提取.Email:lql3388@126.com.

R285

A

1671-5470(2016)03-0296-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.010