蘇現(xiàn)波　王更先

(邯鄲學(xué)院，河北 邯鄲 056005)

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響應(yīng)面法優(yōu)化魚尾鰭抗氧化肽酶解工藝

蘇現(xiàn)波王更先

(邯鄲學(xué)院，河北 邯鄲 056005)

對酶解法制備魚尾鰭抗氧化肽的最佳工藝進行探討，以期為豐富魚尾鰭應(yīng)用領(lǐng)域，開發(fā)高附加值水產(chǎn)品提供理論依據(jù)。以羥自由基清除率為評價指標(biāo)，通過響應(yīng)面分析得到最佳酶解工藝為：底物濃度15%(w/v)，酶解pH=8.403，溫度54.02℃，加酶量0.6%(w/w)，酶解時間3 h。在此最優(yōu)條件下制備的魚尾鰭抗氧化肽產(chǎn)物對羥自由基的清除率為82.09%，與理論值相比相對誤差為1.38%。同時測得此酶解條件下，魚尾鰭多肽得率為31.68%。

魚尾鰭；抗氧化肽；酶解；羥自由基；響應(yīng)面法

我國是世界上主要的漁業(yè)生產(chǎn)國，但魚類加工會產(chǎn)生大量的下腳料，包括魚頭、魚骨、內(nèi)臟和魚尾鰭等，約占原料魚的40%～55%[1]。據(jù)統(tǒng)計，2003年我國魚類加工的廢棄物總量就達到200萬噸以上。目前，發(fā)達國家的水產(chǎn)品加工率在80%以上，而我國的水產(chǎn)品加工率不足30%[2]。這些下腳料中不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和微量元素，還含有多種活性物質(zhì)。因此合理開發(fā)利用這些低值水產(chǎn)品下腳料具有一定的經(jīng)濟效益和社會意義。

魚尾鰭中粗蛋白含量高達40%左右[3]，可作為優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)蛋白的來源。目前工業(yè)上只是將魚尾鰭加工成飼料魚粉，或是作為廢料處理，造成資源的極大浪費和環(huán)境污染。魚類多肽不僅具有魚類蛋白質(zhì)的優(yōu)點，在功能特性與生物活性方面又得到極大的改善，具有良好的溶解性、熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)以及易消化吸收、抗氧化活性、降血壓活性等生理功能[4]，近年來得到國內(nèi)外學(xué)者的研究和推崇[5～7]。因此本文采用酶解方法制備魚尾鰭抗氧肽，利用單因素實驗和響應(yīng)面分析優(yōu)化得到最佳酶解工藝，最終獲得高得率和抗氧化性的魚尾鰭酶解產(chǎn)物，從而為魚尾鰭的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，減少環(huán)境污染并提高水產(chǎn)品加工的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚尾鰭(邯鄲市菜市場)；堿性蛋白酶(BR 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司)；牛血清白蛋白(BR 上海如吉生物科技有限發(fā)展公司)；Tris試劑(GR Sigma)；福林酚試劑(BR 國藥集團)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、十二烷基磺酸鈉(SDS)、硼砂、硫酸銅、酒石酸鈉、硫酸鈉、鹽酸、抗壞血酸、鄰苯三酚、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫(AR 國藥集團)。

1.2 儀器與設(shè)備

JA3003B型電子天平(上海精天電子儀器有限公司)；SHZ-B水浴恒溫震蕩器(上海將任實驗設(shè)備有限公司)；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海將任實驗設(shè)備有限公司)；PHS-25數(shù)顯酸度計(杭州雷磁分析儀器廠)；JYL-C022型九陽料理機(九陽股份有限公司)；5810型臺式高速離心機(德國艾本德股份公司)；FD-1A-50冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；722可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將魚尾鰭剔除魚肉洗凈后冷凍干燥，打成粉備用。

1.3.2 魚尾鰭中各組分的含量分析

蛋白質(zhì)測定：GB/T5009.5—2010 凱氏定氮法；灰分測定：GB/T5009.4-2010 灼燒法；水分測定：GB/T5009.3-2010 干燥法；脂肪測定：氯仿-甲醇法[8]；總糖測定：蒽酮比色法[9]。

1.3.3 魚尾鰭抗氧化肽的制備

稱取15 g魚尾鰭粉末，加入250 mL具塞三角瓶中，加入一定量去離子水，使其底物濃度為15%(w/v)，攪拌均勻，調(diào)節(jié)溶液pH=9.0，60℃下水浴震蕩30 min后加入0.6%堿性蛋白酶開始水解，待酶解3 h后快速于99℃滅活10 min，冷卻后9800 r/min離心28 min，去除上清液中微量油脂及底部沉淀，收集中間部位清液備用。

1.3.4 堿性蛋白酶單因素實驗

按照1.3.3魚尾鰭抗氧化肽制備方法，分別考察底物濃度、pH、溫度、加酶量和酶解時間五種因素[10]對魚尾鰭抗氧化肽多肽得率和抗氧化活性的影響。

各因素水平分別為：底物濃度：5%、10%、15%、20%、25%；pH：7.0、8.0、9.0、10.0；酶解溫度：40℃、50℃、60℃、70℃；加酶量: 0.2%、0.6%、1.0%、1.4%(w/w)；酶解時間：2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。

1.3.5 多肽得率的測定

牛血清白蛋白對照品溶液：精確稱量2.5 mg牛血清白蛋白，用蒸餾水定容于25 mL容量瓶。

標(biāo)準曲線的制備：精密移取對照品溶液0.0 mL，0.5 mL，1 mL，1.5 mL，2 mL，分別置于具塞試管中，各加水至2.0 mL。再分別加入5 mL試劑C(VA液:VB液=1:50；A液為0.5 g硫酸銅和1.0 g酒石酸鈉溶于100 mL蒸餾水中，B液為20.0 g碳酸鈉和4.0 gNaOH溶解于1 L蒸餾水)，混勻于室溫下放置10 min后，各加入0.5 mL試劑D(Folin-酚試劑)，立即混勻，室溫下放置30 min，然后于750 nm處測定其吸光度值。同時以0號管為空白，對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，其相對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，計算線性回歸方程。

樣品的測定：量取1.0 mL酶解液，依標(biāo)準曲線的制備方法，測出酶解液在750 nm處的吸光度值。并計算多肽得率(%)。

式中：c為由標(biāo)準曲線計算得到的多肽提取液的質(zhì)量濃度(mg/mL);V為多肽提取液的體積(mL)；m為樣品粉質(zhì)量(mg)。

1.3.6 抗氧化性的測定

方法測定對羥自由基的清除效率[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚尾鰭中各基本組分的分析結(jié)果

多數(shù)魚類的蛋白質(zhì)含量可達18%～20%，高于肉、禽、蛋、奶的蛋白質(zhì)含量[12]。由表1可以看出，該魚尾鰭主要成分為蛋白質(zhì)，含量為18.96%，與魚肉蛋白質(zhì)含量相近。經(jīng)冷凍干燥后，魚尾鰭粉末中蛋白質(zhì)含量則接近47%。

表1 魚尾鰭中各基本組成成分(%)

2.2 單因素實驗

2.2.1 底物濃度

如圖1所示，隨著底物濃度的增加，多肽得率和羥自由基清除率都表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時，酶與底物接觸幾率小，酶解程度較弱，導(dǎo)致其產(chǎn)生的多肽較少。隨著底物濃度的增加，多肽得率也隨之增加。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0%時，其多肽得率達到最高。若底物濃度繼續(xù)增加，多肽得率反而下降，其原因是該體系底物濃度增加導(dǎo)致溶液黏度提高，因此降低體系中底物和蛋白酶的反應(yīng)接觸能力，從而抑制酶解作用。從圖1還可得知，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5%時，羥自由基清除率達到最大值。

2.2.2 pH

pH通過影響酶的穩(wěn)定性、酶與底物的結(jié)合以及酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物，從而影響酶的催化效果[13]，因此pH是酶解反應(yīng)的重要因素之一。結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯觯趐H7.0～8.0范圍，多肽得率和羥自由基清除率隨pH上升而增加。在超過pH 9后則呈現(xiàn)下降趨勢。考慮到實驗所用酶為堿性蛋白酶，故選擇pH范圍8.0～10.0。

2.2.3 溫度

溫度對酶的穩(wěn)定性及反應(yīng)速率皆有一定影響。酶解溫度過高則會破壞蛋白酶特定空間構(gòu)象，從而破壞蛋白酶活性中心，降低其活性；若酶解溫度過低，則降低酶解體系內(nèi)的分子運動，使底物和酶活性分子的碰撞幾率降低[14]。酶解溫度對多肽得率及羥自由基清除率的影響如圖3所示。隨著酶解溫度升高，多肽得率和羥自由基消除率呈先升高后下降的趨勢。在55℃～60℃時，多肽得率和羥自由基消除率較高。當(dāng)溫度高于60℃時，兩者反而下降，可能是由于溫度升高導(dǎo)致蛋白酶結(jié)構(gòu)改變，活性降低。因此，在后續(xù)實驗中，選擇酶解溫度為不高于60℃。

2.2.4 加酶量

由圖4可知，隨著加酶量的增加，多肽得率和羥自由基清除率逐漸增加。當(dāng)加酶量高于0.6%時，加酶量對多肽得率和羥自由基清除率均不再有顯著影響。說明當(dāng)加酶量為0.6%時，酶分子與底物的結(jié)合已達到飽和。因此在酶解實驗中，確定最佳加酶量為0.6%。

2.2.5 酶解時間

由圖5可知，酶解前3h內(nèi)，多肽得率和羥自由基清除率隨酶解時間增加逐步上升。酶解時間長于3h時，酶解時間不再對多肽得率有顯著影響，而羥自由基清除率降低，可能是隨著酶解時間延長，部分具有抗氧化活性的多肽被繼續(xù)水解導(dǎo)致抗氧化性降低。因此，本實驗確定堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的較優(yōu)反應(yīng)時間為3h。

2.3 響應(yīng)面

根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果，確定使用堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的基本工藝參數(shù)，下一步以抗氧化活性即羥自由基的清除率為評價指標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法對酶解反應(yīng)進行優(yōu)化。

在單因素實驗的分析結(jié)果基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的Box-Behnken響應(yīng)面的設(shè)計方法，選擇底物濃度、酶解pH以及溫度這三個相對來說影響較大的因素進行響應(yīng)面試驗，試驗因素水平的設(shè)計見表2[15,16]。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平

2.3.1 響應(yīng)面分析設(shè)計及結(jié)果

以底物濃度、pH以及反應(yīng)溫度為自變量的三因素三水平試驗共17組，經(jīng)軟件Design Expert 8.05設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平，具體試驗設(shè)計及結(jié)果如表3和表4所示。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表4 回歸模型的方差分析

通過軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到回歸方程為：

Y=68.80+3.90A-4.47B+3.10C-9.56AB-2.39BC+5.73A2-5.63C2。

由表4可知，該模型的P=0.0117<0.05，失擬性在α=0.05水平上不顯著(P=0.2682>0.05)，表明該模型差異顯著，能正確反映魚尾鰭酶解過程中底物濃度、酶解pH以及反應(yīng)溫度之間的關(guān)系。

2.3.2 各因素交互作用分析

各因素對羥自由基清除率影響的響應(yīng)曲面圖如圖6～8所示。由圖可看出，隨pH(B)和反應(yīng)溫度(C)的增加，羥自由基的清除率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。從圖6可知，在固定的酶解pH下，隨著底物濃度的增大，羥自由基的清除率先緩慢提高后逐漸減小；而在反應(yīng)溫度一定時，羥自由基的清除率隨底物濃度的增加而增加(如圖7所示)。比較三個因素的兩兩交互作用圖，A(底物濃度)與B(酶解pH)的交互作用對羥自由基清除率的影響較大，表現(xiàn)為在選定的取值區(qū)間內(nèi)曲面響應(yīng)值變化大，這與回歸模型方差分析中的AB項P<0.01結(jié)果一致。

2.3.3 回歸模型的驗證試驗

經(jīng)軟件Design Expert 8.05優(yōu)化后，分析得到最佳的實驗參數(shù)為：底物濃度為15%(w/v)，酶解為pH=8.403，反應(yīng)溫度為54.02℃。對最佳方案進行驗證，測得羥自由基清除率為82.09%，與理論預(yù)測的最大值83.2432%相比，相對誤差為1.38%，說明該模型可較好的預(yù)測堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的反應(yīng)條件和羥自由基清除率的關(guān)系，同時也證明響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解魚尾鰭制備抗氧化肽工藝參數(shù)的科學(xué)性和可行性，此酶解條件下測得多肽得率為31.68%。

3 結(jié)論

選用堿性蛋白酶對魚尾鰭進行酶解，以多肽得率和對羥自由基的清除率為指標(biāo)，采用單因素實驗和響應(yīng)面分析優(yōu)化對酶解魚尾鰭的主要影響因素底物濃度、pH、溫度、加酶量和酶解時間進行優(yōu)化，并建立了基于魚尾鰭抗氧化肽酶解條件的優(yōu)化模型。試驗結(jié)果表明：底物濃度15%，pH=8.403，反應(yīng)溫度54.02℃，加酶量0.6%，酶解時間3h，酶解產(chǎn)物的抗氧化性最佳，對羥自由基清除率為82.09%，與預(yù)測值相比相對誤差為1.38%，表明該模型可較好的預(yù)測堿性蛋白酶酶解魚尾鰭的反應(yīng)條件和羥自由基清除率的關(guān)系。該研究為魚尾鰭的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，可減少環(huán)境污染并提高水產(chǎn)品加工的附加值。

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[責(zé)任編校：張彩紅]

2016-03-22

邯鄲市科技局科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(1422104057-4)。

蘇現(xiàn)波，男，河北邯鄲人，邯鄲學(xué)院講師。

TS254.9

A

1009-5462(2016)01-0053-07