鄭 薇， 許 穎， 凌保東

（1.成都醫(yī)學(xué)院 結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院，四川 成都610513；3.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都610041）

3種方法測(cè)定替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的體外藥敏結(jié)果比較

鄭 薇1，3， 許 穎2， 凌保東*1

（1.成都醫(yī)學(xué)院 結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院，四川 成都610513；3.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都610041）

比較替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的體外藥敏試驗(yàn)不同方法之間的差異。分別采用微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和K-B法測(cè)定119株臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性，比較不同檢測(cè)方法結(jié)果的差異。微量肉湯稀釋法MIC500.5 μg/mL、MIC901 μg/mL，F(xiàn)DA/EUCAST的耐藥率0.0%（0/119）/0.0%（0/119），中介率0.0%（0/119）/5.0%（6/119），敏感率100%（119/119）/95.0% （113/119）；瓊脂稀釋法MIC501 μg/mL、MIC904 μg/mL，F(xiàn)DA/EUCAST耐藥率 11.7%（14/119）/ 45.4%（54/119），中介率33.6%（40/119）/21.0%（25/119），敏感率54.7%（65/119）/33.6%（40/119）；K-B法Jone/EUCAST的敏感率47.1%（56/119）/31.9%（38/119）、中介率48.74%（58/119）/31.9% （38/119），耐藥率4.2%（5/119）/36.2%（43/119）。替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌體的外藥敏實(shí)驗(yàn)中，微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和K-B法之間存在差異。以微量肉湯稀釋法為參考方法，MH瓊脂稀釋法總誤差41.2%～60.5%，K-B法總誤差47.9%～63.9%。

鮑曼不動(dòng)桿菌；最低抑菌濃度；紙片擴(kuò)散法；替加環(huán)素

近年來替加環(huán)素治療多重耐藥 （Multi-drug resistance，MDR）革蘭陰性菌感染特別是對(duì)碳?xì)涿赶╊惸退幍孽U曼不動(dòng)桿菌的感染取得了較好的療效。替加環(huán)素2012年在中國批準(zhǔn)上市后迅速成為臨床和科研關(guān)注的焦點(diǎn)。替加環(huán)素（Tigecycline，TGC）是半合成米諾環(huán)素的衍生物，屬于甘酰胺環(huán)素（Glycylcycline）類抗生素。隨著替加環(huán)素在臨床使用的不斷增加，檢驗(yàn)科室需要提供更加準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥。選擇美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）［1］藥敏檢測(cè)推薦的方法：微量肉湯稀釋法（BDM）、瓊脂稀釋法（ADM）和K-B法，檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性，為TGC對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)的選擇和結(jié)果解釋提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)株 銅綠假單胞菌ATCC27853，大腸埃希菌ATCC25922，購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心；鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606購自美國ATCC菌種庫。

1.1.2 臨床分離株 119株鮑曼不動(dòng)桿菌，2012年9月至2013年9月分離于成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院痰液、灌洗液、腦脊液、胸水和咽拭子等不同患者的臨床標(biāo)本，所有菌株經(jīng)法國生物-梅里埃ATB測(cè)試儀鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌。

1.2 抗菌藥物

注射用替加環(huán)素（粉劑，批號(hào)：H20110568），購自美國惠氏制藥有限公司。替加環(huán)素藥敏紙片（15 μg/片）購自英國OXOID公司。

1.3 培養(yǎng)基、儀器及耗材

Mueller-Hinton agar（OXOID），Mueller-Hinton broth（OXOID），多點(diǎn)接種儀SAKUMA MIT-P型：日本佐久間公司產(chǎn)品；電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司公司產(chǎn)品；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司公司產(chǎn)品；一次性使用培養(yǎng)皿，無菌96孔板：江蘇康健公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 96-孔板微量肉湯稀釋法測(cè)定替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感性 新鮮配制12.8 mg/mL的替加環(huán)素母液，TGC終質(zhì)量濃度從64 μg/mL倍比稀釋到0.062 5 μg/mL共11個(gè)質(zhì)量濃度梯度。采用96-孔板微量稀釋法測(cè)定替加環(huán)素對(duì)受試菌株的MIC，具體方法參考CLSI文獻(xiàn)［1］。

1.4.2 瓊脂稀釋法測(cè)定替加環(huán)素對(duì)株鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感性 新鮮配置含不同藥物濃度的瓊脂平板，TGC終質(zhì)量濃度從 128 μg/mL倍比稀釋到0.031 25 μg/mL共13個(gè)質(zhì)量濃度梯度。采用瓊脂稀釋法測(cè)定替加環(huán)素對(duì)受試菌株的MIC，具體方法參考CLSI文獻(xiàn)［1］。

1.4.3 K-B法測(cè)定替加環(huán)素對(duì)株鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感性 參考文獻(xiàn)［1-2］中K-B法的標(biāo)準(zhǔn)操作，測(cè)定替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌藥物的體外抑菌活性，用精密度為l mm的游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑 （抑菌圈的邊緣應(yīng)是無明顯細(xì)菌生長的區(qū)域）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 敏感性分析 微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法的判定標(biāo)準(zhǔn)參考美國食品藥品監(jiān)督局 （Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）腸桿菌科標(biāo)準(zhǔn)和歐洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)（European Committee on Antimicrobial susceptibility testing，EUCAST）標(biāo)準(zhǔn)；K-B法的判定標(biāo)準(zhǔn)參考Jones標(biāo)準(zhǔn)［3］和EUCAST標(biāo)準(zhǔn)［4］，分析鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性。

1.5.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 以微量肉湯稀釋法為參考，評(píng)估與其它方法的一致性［5-7］，用軟件WHONET5.6中分類一致率（categorical agreement，CA）、基本一致率（essential agreement，EA）、極嚴(yán)重錯(cuò)誤（very major error，VME）、嚴(yán)重錯(cuò)誤（major error，ME）、一般錯(cuò)誤（minor error，mE）、總誤差（total errors，TE）等指標(biāo)對(duì)不同藥敏方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)VME＜1.5%、ME＜3%和TE＜10%時(shí)認(rèn)為結(jié)果可以接受。

用軟件SPSS13.0對(duì)不同判定標(biāo)準(zhǔn)的耐藥率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，其中P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADM和BMD法檢測(cè)替加環(huán)素對(duì)119株鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC比較與分析

采用瓊脂稀釋法和微量肉湯稀釋法測(cè)定鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)TGC的MIC，分析其MIC50和MIC90，結(jié)果見表1。

表1 兩種方法測(cè)得替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MICTable1 Tigecyclin MICs for A.baumannii with two test methods

由表1可知，微量肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法檢測(cè)替加環(huán)素對(duì)臨床分離的119株鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC明顯不同，微量肉湯稀釋法MIC50和MIC90分別是0.5和1 μg/mL，而瓊脂稀釋法的MIC50和MIC90分別是2和4 μg/mL。說明微量肉湯稀釋法測(cè)定的MIC50和MIC90約為瓊脂稀釋法對(duì)應(yīng)值的1/4，即瓊脂稀釋法的MIC高于微量肉湯稀釋法的MIC 2個(gè)稀釋梯度。

2.2 3種方法檢測(cè)替加環(huán)素的敏感性結(jié)果

分別參考FDA/EUCAST標(biāo)準(zhǔn)，分析ADM法和BDM法檢測(cè)替加環(huán)素對(duì)臨床119株鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率；參考Jone/EUCAST標(biāo)準(zhǔn)，分析K-B法檢測(cè)替加環(huán)素對(duì)臨床119株鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率，結(jié)果見表2。

表2 BDM法、ADM法、K-B法測(cè)定鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性Table2 Tigecycline Susceptibility test by broth microdilution，agar dilution and disk diffusion for A. baumannii

由上表可知，采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）推薦的瓊脂稀釋法、微量肉湯稀釋法和K-B 法3種檢測(cè)方法，測(cè)得的臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性明顯不同。其中微量肉湯稀釋法檢測(cè)（FDA/EUCAST）的耐藥率為0.0%（0/119）/0.0% （0/119），中介率0.0%（0/119）/5.0%（6/119），敏感率100%（119/119）/95.0%（113/119）；瓊脂稀釋法檢測(cè)（FDA/EUCAST）的耐藥率 11.7%（14/119）/45.4% （54/119），中介率33.6%（40/119）/21.0%（25/119），敏感率54.7%（65/119）/33.6%（40/119）；K-B法檢測(cè)（Jone/EUCAST）的敏感率47.1%（56/119）/31.9%（38/ 119），中介率48.74%（58/119）/31.9%（38/119），耐藥率4.2%（5/119）/36.2%（43/119）。

2.3 參考FDA（Jone）和EUCAST標(biāo)準(zhǔn)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素耐藥率的差異

以119株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)TGC的耐藥率為指標(biāo)，采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)，比較分析3種檢測(cè)方法的結(jié)果參考不同判定標(biāo)準(zhǔn)耐藥率的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，分析結(jié)果見表3。

由上表可知，119株菌采用3種方法進(jìn)行檢測(cè)，分別用FDA（Jone）/EUCAST標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性亦存在明顯差異。其中微量肉湯稀釋法（FDA和EUCAST）的耐藥率均為0%（0/119），符合率較高，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而瓊脂稀釋法（FDA和EUCAST）的耐藥率分別為11.7%（14/119）和45.4%（54/119），有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。K-B法（Jone和EUCAST）的耐藥率分別為4.2%（5/119）和36.2%（43/119），有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 參考不同判定標(biāo)準(zhǔn)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率差異Table3 Difference in A.baumannii to tigecycline resistance rates reference to two standards

2.4 3種方法檢測(cè)藥物敏感性差異的比較

基于上述BDM法受到不同藥敏折點(diǎn)的影響最小，作者以BDM法為參考，分析ADM和K-B法檢測(cè)方法的總誤差，比較分析不同檢測(cè)方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果見表4。

表4 兩種方法與BDM法之間比較結(jié)果Table4 Comparsion between broth microdilution with other two test methods

由上表可知，以BDM法為參考，統(tǒng)計(jì)分析ADM 的EA為20.2%（24/119），F(xiàn)DA標(biāo)準(zhǔn)的CA為53.8% （64/119），EUCAST標(biāo)準(zhǔn)的 CA為 42.9%（51/119）；K-B法的 Jone標(biāo)準(zhǔn)的 CA為 47.1%（56/119）；EUCAST標(biāo)準(zhǔn)的CA為31.1%（37/119）。

瓊脂稀釋法FDA總誤差為41.2%；瓊脂稀釋法EUCAST總誤差為60.5%，K-B法Jone總誤差為47.9%，EUCAST總誤差為63.9%，兩種方法雖未出現(xiàn)（VEM）極大誤差，但ME和mE均超過誤差可接受范圍。

3 討論

目前CLSI尚未給出關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)TGC的標(biāo)準(zhǔn)藥敏測(cè)定方法和藥敏判讀標(biāo)準(zhǔn)，選擇CLSI推薦的微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和K-B法3種藥敏試驗(yàn)方法檢測(cè)TGC對(duì)119株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌的敏感性，結(jié)果顯示不同方法差異性大，與文獻(xiàn)報(bào)道［3-5］一致。分析差異主要有3個(gè)方面。

1）方法學(xué)差異 微量肉湯稀釋法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的MIC50和MIC90分別是0.5 μg/ mL和1 μg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果［11］一致。以微量肉湯稀釋法為參考方法，瓊脂稀釋法和K-B法的誤差率均較高。其中瓊脂稀釋法總誤差為 41.2%～60.5%，分類一致率42.9%～53.8%；K-B法總誤差為47.9%～63.9%，分類一致率31.1%～47.1%。瓊脂稀釋法比肉湯稀釋法平均高2個(gè)稀釋度引起mE偏高，從而引起總誤差（TE）偏高。而K-B法的mE也達(dá)到了45.4%～46.2%。一直以來，K-B法都因藥敏折點(diǎn)復(fù)雜（FDA、Jones［2］、Kulah［6］、EUCAST和Thamlikitkul［7］等）存在爭議，而本實(shí)驗(yàn)也顯示瓊脂稀釋法和K-B法均與肉湯稀釋法符合性不好［8-9］。

2）參考標(biāo)準(zhǔn)差異 因FDA和EUCAST兩套標(biāo)準(zhǔn)差異較大，導(dǎo)致同一藥敏檢測(cè)方法分析的結(jié)果差異較大，在解釋替加環(huán)素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的藥敏結(jié)果時(shí)，測(cè)定方法和判定標(biāo)準(zhǔn)都十分關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用FDA和EUCAST兩套標(biāo)準(zhǔn)，肉湯稀釋法耐藥率無差異（P＞0.05），而瓊脂稀釋法檢測(cè)的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率11.7%～45.4%、K-B法檢測(cè)的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率為4.2%～46.2%，兩者均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。基于此，在比較3種不同檢測(cè)方法的差異時(shí)，作者選擇了肉湯稀釋法作為參考方法，以提高分析的準(zhǔn)確性。

3）藥物的不穩(wěn)定性 據(jù)報(bào)道，替加環(huán)素理化性質(zhì)活潑，在光線或空氣中久置會(huì)導(dǎo)致抗菌活性降低［10］。此外，培養(yǎng)基中的離子如錳離子因與抗菌藥物形成螯合物是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素［11］。因此，為縮短替加環(huán)素在空氣和光線中的暴露時(shí)間，藥物采用現(xiàn)配現(xiàn)用的原則，同時(shí)選用OXOID公司生產(chǎn)的錳離子含量較低的MH培養(yǎng)基，避免外界環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。

結(jié)果表明，在微量肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法和K-B法中，微量肉湯稀釋法受不同判定標(biāo)準(zhǔn)的影響最小，該方法本身也是目前替加環(huán)素藥敏試驗(yàn)的參考方法。目前關(guān)于鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的報(bào)道較多，但因方法和判定標(biāo)準(zhǔn)各異，導(dǎo)致不同研究者的報(bào)道結(jié)果不具有可比性。因此，建議進(jìn)一步規(guī)范肉湯稀釋法操作，制定詳細(xì)規(guī)程和統(tǒng)一藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)，為臨床鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素敏感性試驗(yàn)和合理運(yùn)用替加環(huán)素治療感染性疾病提供科學(xué)依據(jù)。

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Comparison of Three Methods in Vitro Susceptibility Test of Tigecycline Against Acinetobacter baumannii

ZHENG Wei1，3， XU Ying2， LING Baodong*1
（1.Small Molecule Drugs Sichuan Key Laboratory，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.The First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610513，China；3.Sichuan Provincial Center for Disease Control and Prevention，Chengdu 610041，China）

To evaluate different tigecyclin susceptibility testing methods for Acinetobacter baumannii.A total of 119 clinical A.baumannii isolates were collected and tigecycline susceptibilities were tested by the broth microdilution，agar dilution and disk diffusion.The results of three test methods were compared.The MIC50and MIC90values obtained by broth microdilution method were 0.5 μg/mL，1 μg/mL respectively，the（FDA/EUCAST breakpoint）susceptible rates were 100% （119/119）/95.0%（113/119），intermediate rates were 0.0%（0/119）/5.0%（6/119）and resistant rateswere 0.0%（0/119）/0.0%（0/119）.The MIC50and MIC90values obtained by agar dilution method were 2 μg/mL，4 μg/mL respectively，the（FDA/EUCAST breakpoint）susceptible rates were 54.7% （65/119）/33.6%（40/119），intermediate rates were 33.6%（40/119）/21.0%（25/119）and resistant rates were 11.7%（14/119）/45.4%（54/119）.The disk diffusion method（FDA/EUCAST breakpoint）resistant rates were 4.2%（5/119）/36.2%（43/119），intermediate rates were 48.74%（58/119）/31.9% （38/119）and susceptible rates were 47.1%（56/119）/31.9%（38/119）.There were significant differences on susceptible rates among broth microdilution（BDM），agar dilution（ADM）and disk diffusion.As broth microdilution method was reference method，the total error rates of agar dilution method were 41.2%～60.5%and the total error rates of disk diffusion were 47.9%～63.9%.

Acinetobacter baumannii，minimal inhibitory concentration （MIC），disk diffusion，tigecycline

R 446.5；R 978.1

A

1673—1689（2016）07—0734—05

2014-06-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373454）；四川省科技廳重點(diǎn)科技項(xiàng)目（2013jy0065）。

凌保東（1956—），男，重慶萬州人，醫(yī)學(xué)碩士，教授，主要從事抗生素耐藥機(jī)制研究。E-mail：lingbaodong@cmc.edu.cn