王宜君， 湯朝起， 嚴(yán)新龍， 許贛榮*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 /工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海200082；3.江蘇太倉(cāng)海煙煙草薄片有限公司，江蘇 蘇州215400）

固態(tài)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液成分分析

王宜君1， 湯朝起2， 嚴(yán)新龍3， 許贛榮*1

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 /工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海200082；3.江蘇太倉(cāng)海煙煙草薄片有限公司，江蘇 蘇州215400）

對(duì)低次煙葉分別進(jìn)行高溫高水分好氧和厭氧發(fā)酵，烘干，陳化一周后制備提取液，應(yīng)用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用HS-SPME-GC-MS對(duì)不同提取液中的揮發(fā)性致香成分進(jìn)行分析比較，并將濃縮后提取液涂布于片基上進(jìn)行評(píng)吸。結(jié)果表明，經(jīng)高溫高水分好氧和厭氧發(fā)酵低次煙葉制備的提取液中揮發(fā)性致香成分種類(lèi)分別為52種、51種，合計(jì)質(zhì)量濃度分別為43.38 μg/mL、40.16 μg/mL。而未經(jīng)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液中揮發(fā)性致香成分種類(lèi)為34種，合計(jì)質(zhì)量濃度為23.61 μg/mL；低次煙葉經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后所得提取液中酸類(lèi)、酯類(lèi)、酮類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)等致香成分均有不同程度的增加，増香除雜效果明顯，能夠改善煙草薄片的吸食品質(zhì)。

低次煙葉；發(fā)酵；萃取液；香氣成分

低次煙葉是卷煙生產(chǎn)中質(zhì)量較差的產(chǎn)品，合理開(kāi)發(fā)利用這些產(chǎn)品用于造紙法再造煙葉，可產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益［1-2］。已知低次煙葉中含有3 000多種化合物，包括糖類(lèi)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等以及各種煙草致香物質(zhì)。對(duì)低次煙葉進(jìn)行綜合利用，已成為煙草、化工、香精、醫(yī)藥等行業(yè)科研工作者關(guān)注的問(wèn)題。但研究重點(diǎn)集中在如何提取其相應(yīng)化學(xué)成分上，如提取煙堿和茄尼醇，或采用各種萃取技術(shù)制備煙用香精香料。而對(duì)煙草發(fā)酵產(chǎn)香的開(kāi)發(fā)利用也僅限于制備一些煙用浸膏［3］。

在造紙法再造煙葉生產(chǎn)工藝中，一般是以煙梗、煙末及碎煙葉等作為原料，通過(guò)提取工藝制備提取液，經(jīng)濃縮后用于煙草薄片的涂布液。這一過(guò)程主要是物理加工過(guò)程。低次煙葉含有大量的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，可被微生物利用；將低次煙葉在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵，促進(jìn)有益微生物在低次煙葉上的生長(zhǎng)及發(fā)酵，則在發(fā)酵過(guò)程中，會(huì)降解煙葉中的部分化合物，同時(shí)產(chǎn)生一定量的代謝產(chǎn)物，因而經(jīng)過(guò)發(fā)酵的低次煙葉，提取后有可能得到品質(zhì)更優(yōu)良的提取液。作者以固態(tài)發(fā)酵低次煙葉為原料，制備提取液［4］，以期提高提取液的品質(zhì)、降低煙草薄片的青雜氣、刺激性，提高相應(yīng)煙草本香香味物質(zhì)種類(lèi)和含量。

利用微生物發(fā)酵低次煙葉產(chǎn)香具有原料易得、成本低、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［5-6］。深入開(kāi)展低次煙葉的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究，開(kāi)發(fā)出適用于中式卷煙的新型煙草薄片，是造紙法再造煙葉技術(shù)研究的重點(diǎn)工作之一［7］?？紤]到再造煙葉是以水對(duì)煙草原料進(jìn)行提取，故本實(shí)驗(yàn)以高溫、高水分為發(fā)酵條件對(duì)低次煙葉分別進(jìn)行好氧和厭氧固態(tài)發(fā)酵，并以其為原料制備煙草提取液，采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用方法，分析不同萃取液中的揮發(fā)性致香成分，并與未經(jīng)發(fā)酵的低次煙葉制備的提取液進(jìn)行對(duì)比，以期為低次煙葉發(fā)酵在造紙法再造煙葉領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)［8-10］。

1 材料與方法

1.1 原料

低次煙葉：2012年福建煙葉上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供；濃硫酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、硼酸、醋酸、硫酸鉀、3，5-二硝基水楊酸：中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.2 設(shè)備

UV3000型-可見(jiàn)光分光光度計(jì)：日本Hitachi公司產(chǎn)品；紅外智能8孔消化爐：上海沛歐分析儀器有限公司產(chǎn)品；SKD-200凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司產(chǎn)品；DZF-6050型真空干燥箱改造培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；YHG-300BS型鼓風(fēng)恒溫干燥箱：上海康路儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；同時(shí)蒸餾裝置：上海達(dá)豐玻璃儀器廠產(chǎn)品；甘蔗榨汁機(jī)：上海中造機(jī)械有限公司產(chǎn)品；RE52-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海滬西分析儀器廠有限公司產(chǎn)品；氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：Trace1300/TSQ8000美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；自制數(shù)顯可控恒溫水浴加熱固態(tài)發(fā)酵裝置。

1.3 固態(tài)發(fā)酵方法

煙葉分為3組：未發(fā)酵的低次煙葉，高溫高水分好氧發(fā)酵低次煙葉和高溫高水分厭氧發(fā)酵低次煙葉。

1.3.1 高溫高水分好氧發(fā)酵低次煙葉條件 取低次煙葉2 kg，預(yù)先測(cè)定其水分含量，將煙葉攤開(kāi)在不銹鋼盤(pán)中，用噴壺噴灑一定量的水至煙葉，并混勻，使煙葉最終水分為50%，將潮濕煙葉裝入自制的固態(tài)發(fā)酵裝置中，置于50℃發(fā)酵6 d，取出低次煙葉于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干3 h至煙葉水分12%左右，室溫自然陳化一周。

1.3.2 高溫高水分厭氧發(fā)酵條件 取低次煙葉0.5 kg，噴水方法同上，至水分50%，裝入自封袋中，排出空氣，置于真空干燥箱改造的培養(yǎng)箱中45℃發(fā)酵4d，取出低次煙葉置于60℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至煙葉水分12%左右，室溫自然陳化一周。

1.3.3 萃取液的制備 以水為萃取劑，低次煙葉為原料，料水質(zhì)量體積比（1 g∶10 mL），置于3 L燒杯中，玻璃棒間隔10 min攪拌一次，放入60℃恒溫水浴箱中提取1.5 h后，以甘蔗榨汁機(jī)擠壓物料，得到提取液。

1.4 分析方法

1.4.1 煙草常規(guī)化學(xué)成分的測(cè)定 還原糖、總糖的測(cè)定—DNS法［11］；粗蛋白及總氮的測(cè)定—?jiǎng)P氏定氮法［12］；煙堿的測(cè)定—紫外分光度法［13］；內(nèi)標(biāo)法（乙酸苯乙酯）定量分析［14］；可溶性固形物含量的測(cè)定：取提取液100 mL于500 mL圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)真發(fā)儀60℃真空濃縮至無(wú)游離水后，105℃干燥箱中烘干至恒重，稱(chēng)量。

1.4.2 致香成分的測(cè)定 樣品前處理：取100 mL提取液放入圓底燒瓶中，加入20 mL二氯甲烷，置于同時(shí)蒸餾萃取裝置進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取液，干燥濃縮至1 mL，加入乙酸苯乙酯作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行GC-MS分析。SPME分析條件：取8 mL萃取液，置于頂空瓶中，采用50 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取頭吸附樣品后在孵化池中預(yù)熱5 min，50℃萃取30 min。取出萃取頭，立即插入GC-MS儀進(jìn)樣口（溫度250℃）中解吸7 min，進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS分析條件：色譜柱：7G-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：初溫40℃，保持3 min，以8℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持8 min；載氣：He，流量1 mL/min；EI離子源溫度：230℃；分流比：10∶1；電離能量：70 eV；掃描范圍：33～450。

1.5 涂布還原煙草薄片評(píng)吸

將100 mL濃縮后的提取液均勻涂布于片基上，涂布率為30%，置于80℃鼓風(fēng)干燥箱中快速烘干后，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱（溫度25℃、相對(duì)濕度60%）中維持煙草薄片含水率在12%左右48 h，切絲分別卷成10只單料煙，由10人專(zhuān)業(yè)評(píng)吸小組分別對(duì)香氣量、甜潤(rùn)感、刺激性、青雜氣、灼燒感、透發(fā)性、余味等7個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)吸。

2 結(jié)果與討論

以下所有結(jié)果中Ⅰ組表示未發(fā)酵的低次煙葉制備的煙草提取液；Ⅱ組表示高溫高水分好氧發(fā)酵低次煙葉制備的煙草提取液；Ⅲ組表示高溫高水分厭氧發(fā)酵低次煙葉制備的煙草提取液。

2.1 煙草萃取液基本理化成分分析

檢測(cè)3種低次煙葉制備的煙草提取液基本物理和化學(xué)指標(biāo)。結(jié)果如表1所示。

表1 未濃縮煙草提取液的基本理化性質(zhì)Table1 Chemical composition and physical properties of tobacco extracts before concentration

從表1可知，經(jīng)過(guò)發(fā)酵的Ⅱ組和Ⅲ組與未發(fā)酵的Ⅰ組相比，其可溶性固形物含量增加和pH值降低，說(shuō)明低次煙葉自身的大分子物質(zhì)經(jīng)微生物發(fā)酵后降解為更易于提取的小分子物質(zhì)，或酸性代謝產(chǎn)物使得提取液中的pH降低；Ⅱ、Ⅲ兩組的HTJ值較Ⅰ組更趨于合理，若提取液中糖高煙堿低，則利用它涂布后的煙草薄片燃吸時(shí)煙氣勁頭低，吸味平淡，香氣不足。相反若煙堿高糖低，則煙氣勁頭大，不醇和吸后無(wú)舒適感。一般HTJ值維持在10～15：1較為合理；Ⅰ組的兩糖差值比Ⅱ、Ⅲ兩組略高，即其還原糖相對(duì)于總糖含量高，能有效提高提取液涂布后的煙草薄片吃味。從提取液基本的理化指標(biāo)分析來(lái)看，經(jīng)過(guò)高溫高水分發(fā)酵的Ⅱ、Ⅲ兩組與Ⅰ組相比品質(zhì)有所提高。

2.2 煙草提取液香氣成分的分析比較

利用頂空固相微萃取的方法（SPME）富集煙草提取液中的揮發(fā)性香氣成分，采用GC-MS對(duì)萃取頭中吸附的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定，將得到的圖譜經(jīng)NIST譜庫(kù)檢索后確定其化學(xué)成分。按峰面積歸一化法求得各成分相對(duì)質(zhì)量百分含量，采用內(nèi)標(biāo)法（乙酸苯乙酯）進(jìn)行定量分析。分析結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、圖3所示。

2.2.1 酸類(lèi)物質(zhì)分析比較 酸類(lèi)物質(zhì)可以減少雜氣和刺激性，提高細(xì)膩度和圓潤(rùn)感，改善余味。

圖1 Ⅰ組煙草提取液揮發(fā)性成分的GC-MS總離子圖Fig.1 Total ionic chromatogram of volatiles intobacco extracts（group I）by GC-MS

圖2 Ⅱ組煙草提取液揮發(fā)性成分的GC-MS總離子圖Fig.2 Total ionic chromatogram of volatiles intobacco extracts（group II）by GC-MS

圖3 Ⅲ組煙草提取液揮發(fā)性成分的GC-MS總離子圖Fig.3 Total ionic chromatogram of volatiles intobacco extracts（group III）by GC-MS

由表2可知，未經(jīng)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅰ組中酸類(lèi)物質(zhì)有4種，總量為0.69 μg/mL；經(jīng)高溫高水分發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅱ、Ⅲ兩組中酸類(lèi)物質(zhì)有7種，總量分別為1.06、1.23 μg/mL。主要增加了乙酸 （0.14、0.20 μg/mL）、異丁酸（0.26、0.24 μg/mL）等酸類(lèi)致香成分。

表2 煙草提取液中酸類(lèi)致香成分分析比較Table2 Comparison of the acids in tobacco extracts

2.2.2 醇類(lèi)物質(zhì)分析比較 醇類(lèi)物質(zhì)可以有效的減少煙氣的刺激性，使吸味柔和。

由表3可知，未經(jīng)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅰ組中醇類(lèi)物質(zhì)有7種，總量為1.44 μg/mL；而經(jīng)高溫高水分發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅱ、Ⅲ兩組中醇類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)均為11種，總量分別為8.14、11.13 μg/mL；其中Ⅱ、Ⅲ兩組中增加的主要醇類(lèi)致香物質(zhì)有1-戊醇（0.08、0.02 μg/mL）、糠醇（0.02、0.03 μg/mL）、芳樟醇（0.56、0.49 μg/mL）、香茅醇（1.28、1.53 μg/mL）等，這些醇類(lèi)致香物質(zhì)可以使得提取液涂布后的煙草薄片煙氣更加成熟、柔和。

2.2.3 酯類(lèi)物質(zhì)的分析比較 酯類(lèi)物質(zhì)香氣清新、飄逸能夠較好的去除青雜氣，同時(shí)酯類(lèi)物質(zhì)的性質(zhì)與其分子大小具有很重要的關(guān)系，性質(zhì)變化很大，其對(duì)煙氣的貢獻(xiàn)與各物質(zhì)自身結(jié)構(gòu)有關(guān)［15］。

由表4可知，未經(jīng)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅰ組中酯類(lèi)致香成分有8種，總量為6.06 μg/mL；而經(jīng)高溫高水分發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅱ、Ⅲ兩組中酯類(lèi)致香成分種類(lèi)均為13種，總量分別達(dá)到9.52、8.87 μg/mL；Ⅱ、Ⅲ兩組與Ⅰ組相比，從無(wú)到有增加的主要酯類(lèi)致香成分有：二氫獼猴桃內(nèi)酯、棕櫚酸乙酯、己酸乙酯、異丁酸乙酯、戊酸乙酯等。

2.2.4 酮類(lèi)物質(zhì)分析比較 酮類(lèi)物質(zhì)能調(diào)和煙香，增加煙氣生津感，改善煙草薄片吸味。

表3 煙草提取液中醇類(lèi)致香成分分析比較Table3 Comparison of the alcohols in tobacco extracts

表4 煙草提取液中酯類(lèi)致香成分分析Table4 Comparison of the esters in tobacco extracts

由表5可知，未經(jīng)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅰ組中酮類(lèi)致香成分有8種，總量為9.28 μg/mL；經(jīng)高溫高水分發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅱ、Ⅲ兩組中酮類(lèi)致香成分均為10種，總量分別為16.46、13.22 μg/mL；其中Ⅱ、Ⅲ兩組中增加的香葉基丙酮（0.06、0.02 μg/mL）、α-紫羅蘭酮（0.58、0.72 μg/mL）具有濃而甜潤(rùn)的花香，并有良好的擴(kuò)散性，能使經(jīng)提取液涂布的煙草薄片香氣甜醇，改善其粗劣氣，增加天然感和厚實(shí)感；巨豆三烯酮、β-大馬酮、β-紫羅蘭酮、β-二氫大馬酮等致香酮類(lèi)物質(zhì)的含量，Ⅱ、Ⅲ兩組較Ⅰ組均有所提高。

2.2.5 醛類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)分析比較 醛類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)是煙草中重要的增香物質(zhì)，能夠提高卷煙的豐滿(mǎn)度和香氣質(zhì)。

由表6可知，未經(jīng)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅰ組中醛類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)致香成分有7種，含量為6.14 μg/mL；經(jīng)高溫高水分發(fā)酵低次煙葉制備的提取液Ⅱ、Ⅲ組中醛類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)致香成分分別為11種、10種，含量分別為8.20、5.71 μg/mL；2-乙基吡嗪、藏紅花醛等香味物質(zhì)Ⅰ組中均無(wú)出現(xiàn)，Ⅱ、Ⅲ兩組中有出現(xiàn)，可賦予提取液豐滿(mǎn)柔和的風(fēng)味，協(xié)調(diào)薄片煙氣。

表5 煙草提取液中酮類(lèi)致香成分分析Table5 Comparison of the ketones in tobacco extracts

表6 煙草提取液中醛類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)致香成分分析Table6 Comparison of the aldehydes and heterocycles in tobacco extracts

2.3 評(píng)吸結(jié)果

由表7評(píng)吸結(jié)果可以看出，將低次煙葉原料經(jīng)發(fā)酵后制得的提取液涂布片基后，與未發(fā)酵低次煙葉制備提取液涂布片基相比，煙草薄片吸食品質(zhì)有一定程度的改善；Ⅰ組中的薄片香氣弱、刺激性大、木質(zhì)氣較重、略有燒焦味；Ⅱ組中的薄片香氣量增加、質(zhì)感強(qiáng)、細(xì)膩度和舒適度有所提升；Ⅲ組中的薄片甜潤(rùn)感提升、煙氣骨架感好、香氣量和香氣質(zhì)明顯增強(qiáng)。

3 結(jié)語(yǔ)

未經(jīng)發(fā)酵的原低次煙葉制備的提取液中香氣物質(zhì)種類(lèi)為34種，質(zhì)量濃度僅為23.61 μg/mL。而經(jīng)高溫高水分好氧固態(tài)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液中香氣物質(zhì)種類(lèi)為52種，質(zhì)量濃度提高到43.38 μg/mL；經(jīng)高溫高水分厭氧固態(tài)發(fā)酵低次煙葉制備的提取液中香氣物質(zhì)種類(lèi)為51種，質(zhì)量濃度為40.16 μg/mL；兩組發(fā)酵后的低次煙葉制備的提取液與未發(fā)酵的相比，其揮發(fā)性香氣物質(zhì)種數(shù)由多到少的順序?yàn)椋乎ヮ?lèi)＞醛類(lèi)和雜環(huán)類(lèi)＞醇類(lèi)＞酮類(lèi)＞酸類(lèi)。

表7 煙草提取液涂布片基吸食評(píng)價(jià)Table7 Smoking quality evaluation of the tobacco using film base coated with tobacco extracts

作者僅說(shuō)明固態(tài)發(fā)酵后的低次煙葉所制備的提取液的化學(xué)成分發(fā)生了一定的變化，這對(duì)提高涂布液的品質(zhì)有一定的效果，至于如何將生物技術(shù)應(yīng)用于造紙法再造煙葉生產(chǎn)工藝中，如利用微生物發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化提取液増香，改進(jìn)薄片性能等，還有待進(jìn)一步的研究。

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Composition Analysis of Extracts Prepared by Solid-State Fermentation From Discarded Tobacco Leaves

WANG Yijun1， TANG Zhaoqi2， YAN Xinlong3， XU Ganrong*1
（1.School of Biotechnology/Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Shanghai Tobacco Group Co.Ltd.，Shanghai 200082，China；3.Taicang Haiyan Reconstituted Tobacco Co.Ltd.，Suzhou 215400，China）

The fermented extracts were prepared from discarded tobacco leaves using aerobic and anaerobic fermentation with high temperature and high moisture，followed by one-week aging after drying.The volatile components in the extracts were comparatively analyzed by headspace solid-phase micro-extraction （HS-SPME）associated with capillary gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）.The concentrated extracts were coated on film base for smoking quality analysis.There were totally 52 volatile aroma components detected in the aerobic fermentation tobacco extracts with a concentration of 43.38 μg/mL，and for extracts from anaerobic fermentation，there were 51 kinds of 40.16 μg/mL.For the control sample without fermentation，there were 34 components with concentration of 23.61 μg/mL.The contents of acids，esters，ketones，aldehydes，heterocycles were increased at different levels after fermentation.The significant effect of aroma enhancement and impurities removal confirmed that the smoking quality could be improved byfermentation treatments.

discarded tobacco leaf，fermentation，extraction，volatile aroma components

TS 444

A

1673—1689（2016）07—0757—08

2015-01-08

上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（SZBCW201000744）。

許贛榮（1957—），男，江西贛州人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事發(fā)酵工程與生物化工研究。

E-mail：grxu123@126.com