王金玲， 姚麗敏， 曠 慧

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

榛子殼棕色素的分離純化及其理化性質(zhì)的研究

王金玲， 姚麗敏， 曠 慧

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040）

在大孔樹脂一次分離純化榛子殼棕色素粗提液的基礎(chǔ)上，選用D101大孔樹脂對榛子殼棕色素進(jìn)行二次分離純化，通過單因素試驗及正交試驗優(yōu)化大孔樹脂二次分離純化榛子殼棕色素的工藝，試驗結(jié)果表明，上樣質(zhì)量濃度為22 mg/mL，上樣流量為1.5 mL/min，洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)為80%，洗脫流量為2.5 mL/min為最佳純化條件。經(jīng)D101二次分離純化的榛子殼棕色素，色價從44提高到了82.6。對純化后的榛子殼棕色素的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，該色素耐光性好，高溫、色素溶液的pH對該色素的穩(wěn)定性有一定的影響；Na+、Mg2+、K+、Ca2+對其穩(wěn)定性影響小，F(xiàn)e3+、Cu2+、Al3+、Zn2+對其穩(wěn)定性有破壞作用；該色素對淀粉類、禽蛋類、肉類食品的著色性良好。

榛子殼；棕色素；純化；理化性質(zhì)

食用色素是使食品著色或改善食品色調(diào)和色澤的食品添加劑。盡管食品中色素含量甚微，但對食品質(zhì)量品質(zhì)的影響卻非常大。隨著對食品安全問題的重視，消費者對合成色素的安全性問題越來越擔(dān)心，因而天然色素的研究、開發(fā)和應(yīng)用成為持續(xù)熱點。榛子殼中富含類黃酮棕色素［1］，具有抗衰老、降脂、美容、養(yǎng)顏、減肥等重要的生理活性功能，可應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)［2-5］。榛子殼是榛子加工后的主要下腳料，由于其具有堅硬、難溶于水等特性，處理起來很困難，作為廢物丟棄，因此，應(yīng)該加強對榛子殼的利用，增加其經(jīng)濟價值，將其變廢為寶，不僅避免了資源的浪費，也避免了污染環(huán)境等問題。近年來，對榛子殼棕色素的提取已有報道［6-7］，但對于榛子殼棕色素的純化工藝及理化性質(zhì)方面研究較少。

作者旨在經(jīng)大孔樹脂對榛子殼棕色素進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，得到最佳純化工藝及純度較高的榛子殼棕色素，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行研究，以期為榛子殼棕色素的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：毛榛子（Corylus mandshurica Maxim.），購自伊春市五營林業(yè)局。手工去仁，榛子殼烘干粉碎，備用。

試劑：無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等均為國產(chǎn)分析純。

試驗設(shè)備：ALC-1104分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；UV-1200紫外可見分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DFC-6053型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；DL-6M低速離心機：湖南星科科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型pH計：上海偉業(yè)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 榛子殼棕色素粗提液的制備 參照文獻(xiàn)制得榛子殼棕色素粗提液［8］。

1.2.2 榛子殼棕色素的制備 將充分活化的D101樹脂裝于柱中（3 cm×50 cm），在樣液pH=4.0，上樣質(zhì)量濃度為30 mg/mL，飽和吸附量為12.23 mg/mL（樹脂），上樣流量為1.5～2.0 mL/min，洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，洗脫流量為1.5～2.0 mL/min條件下，進(jìn)行大孔樹脂對榛子殼棕色素粗提液的一次純化，制得榛子殼棕色素純物，測定其色價，計算公式如下［9］：E=A×R/m

式中，A為吸光度；m為100 mL被測溶液中所含樣品的質(zhì)量（g）；R為100 mL溶液稀釋至上機測試的稀釋倍數(shù)；E表示樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，1 cm比色皿測得的色價值。

1.2.3 榛子殼棕色素最大吸收波長的確定 根據(jù)分光光度法，將榛子殼棕色素純物溶液在200～500 nm區(qū)間進(jìn)行掃描，確定色素吸收波長。

1.2.4 大孔樹脂對榛子殼棕色素的二次純化

1）分離柱的準(zhǔn)備 將充分活化的150 mL大孔樹脂濕法裝于分離柱（3 cm×50 cm）中，在不同的上樣條件下，使榛子殼棕色素純物溶液通過分離柱，直至樣液全部流出后，用蒸餾水沖洗樹脂至流出液為無色，隨后在相應(yīng)的洗脫條件下進(jìn)行洗脫，收集富集了榛子殼棕色素的洗脫液。

2）單因素試驗 選擇上樣濃度、上樣流量、洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)、洗脫流量為試驗的單因素，單因素試驗水平見表1。采用漸變式優(yōu)化法，初始大孔樹脂二次純化榛子殼棕色素的條件為上樣質(zhì)量濃度為20 mg/mL（吸光值為1.573），上樣體積為200 mL，上樣流量為2.0 mL/min，洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)為65%，洗脫流量為2.0 mL/min，收集流出液，每5mL一管，以大孔樹脂在不同純化條件下的飽和吸附量確定最佳上樣質(zhì)量濃度，以樹脂在不同純化條件下的吸附曲線確定最佳上樣濃度，以樹脂在不同純化條件下的解吸曲線確定最佳洗脫劑 （乙醇）體積分?jǐn)?shù)、洗脫流量。飽和吸附量計算公式如下：飽和吸附量=色素質(zhì)量（mg）/濕樹脂體積（mL）［10］。

表1 單因素試驗因素及水平表Table1 Factors and levels of single-factor experiments

3）正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對D101樹脂二次純化榛子殼棕色素的工藝進(jìn)行優(yōu)化。以上樣質(zhì)量濃度，上樣流量，洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)，洗脫流量為因素，進(jìn)行4因素3水平正交試驗，以純化后的色價為指標(biāo)，確定大孔樹脂二次純化榛子殼棕色素的工藝條件，優(yōu)化D101樹脂二次純化榛子殼棕色素的工藝條件的因素水平見表2。

表2 正交試驗因素及水平表Table2 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.5 純化后的榛子殼棕色素的理化性質(zhì)的研究

1）色素的耐光、耐熱性試驗 將50 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的榛子殼棕色素水溶液分別在避光、室內(nèi)散射光、室外自然光條件下處理4 d，每隔12 h測定其吸光值；在不同溫度（50、70、90℃）下處理24 h，觀察顏色變化［11］，每隔4 h測定色素溶液的吸光值。

2）色素的耐酸堿性試驗 采用檸檬酸、磷酸氫二鈉等溶液配制不同pH的緩沖溶液，作為色素pH穩(wěn)定性試驗的緩沖液。分別量取1 mL質(zhì)量濃度為50 mg/mL的色素水溶液和10 mL對應(yīng)pH的緩沖液，充分混合，每隔12 h測定色素溶液的吸光值。

3）金屬離子對色素的穩(wěn)定性的影響試驗 配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的榛子殼棕色素水溶液，向50 mL的色素溶液中分別加入5 mL的200 mg/L的NaCl、KCl、CaCl2、FeCl3、CuSO4、MgSO4、Al2（SO4）3、ZnSO4水溶液，放置4 d，考察金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響［12］。

4）色素的著色力試驗 將相同質(zhì)量的米飯和白面饅頭、雞蛋蛋白，黃豆、雞脯肉、花生分別置于200 mL濃度為5 mg/mL的榛子殼棕色素溶液中，于室溫下浸泡2 d，觀察榛子殼棕色素的著色效果［13］，同時，測定殘留液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗3次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差顯示數(shù)，據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行分析處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛子殼棕色素一純物吸收波長的測定

在200～500 nm的波長范圍內(nèi)對提取液進(jìn)行掃描，在235 nm處有最大吸收，因此選擇235 nm為測定波長。

2.2 大孔樹脂對榛子殼棕色素的二次純化

2.2.1 上樣質(zhì)量濃度對純化效果的影響 上樣質(zhì)量濃度對純化效果的影響如圖1。

圖1 不同上樣質(zhì)量濃度時的飽和吸附量Fig.1 Adsorption capacity at different sample concentrations

由圖1可知，樹脂飽和吸附量隨著上樣質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度增加到20 mg/mL時，飽和吸附量達(dá)到最大值；但在上樣量繼續(xù)增大時，樹脂的飽和吸附量呈降低趨勢，其原因可能是隨著料液濃度的提高，與色素競爭吸附的雜質(zhì)量也隨之增加，影響了色素等物質(zhì)在樹脂內(nèi)部的擴散［14］，作者認(rèn)為最佳上樣質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

2.2.2 上樣流速對純化效果的影響 上樣流量對純化效果的影響如圖2所示。

圖2 不同上樣流量對純化效果的影響Fig.2 Effect of different flowing velocities on purification

由圖2可知，當(dāng)上樣流量為2.5～3.0 mL/min時，當(dāng)管號為15時就已經(jīng)到達(dá)泄露點，色素溶液與樹脂接觸時間短，這不利于樹脂很好地吸附色素，吸附效率大大下降，也造成了物料的浪費；流速過慢，操作時間長，也降低了工作效率。由圖可見，樣液上樣流量控制在1.5～2.0 mL/min效果最佳，考慮到樹脂的工作效率，最佳上樣流量為2.0 mL/min。

2.2.3 洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)對純化效果的影響洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)對純化效果的影響如圖3所示。

圖3 洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)對純化效果的影響Fig.3 Effect of different ethanol concentrations on purification

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸效果逐漸變好，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到75%時，解吸曲線不僅峰形窄，對榛子殼棕色素的富集效果好，而且，無拖尾現(xiàn)象；體積分?jǐn)?shù)太高的乙醇，解吸能力太強，會將非色素成分解吸下來［15］，影響純度，從而影響后續(xù)試驗的進(jìn)行。因此，作者認(rèn)為75%為最佳洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。

2.2.4 洗脫流量對純化效果的影響 洗脫流量對純化效果的影響如圖4所示。

圖4 洗脫流量對純化效果的影響Fig.4 Effect of different eluting velocities on purification

由圖4可知，隨著洗脫的進(jìn)行，流出液中榛子殼棕色素的質(zhì)量濃度升高到最大以后，又迅速降低，此時已收集到大部分色素，當(dāng)流出液為無色時，說明洗脫已完成。當(dāng)洗脫流速較大時，如2.5～3.0 mL/min，對洗脫出的色素溶液富集效果較好，但是當(dāng)流量達(dá)到3.0 mL/min時，對榛子殼棕色素的純化效果有所降低；當(dāng)流量過低時，有一定的拖尾現(xiàn)象，不利于榛子殼棕色素的富集。當(dāng)洗脫流量為2.5 mL/ min時，不僅對榛子殼棕色素有富集效果，并且榛子殼棕色素的吸光值明顯提高，因此，洗脫流量為2.5 mL/min時，洗脫效果最佳。

2.2.5 正交試驗優(yōu)化大孔樹脂二次純化榛子殼棕色素的工藝條件 將大孔樹脂一純后色價為44的榛子殼棕色素進(jìn)行二次純化，大孔樹脂二次分離純化榛子殼棕色素的正交試驗的結(jié)果及極差分析如表3所示。

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table3 Design and results of orthogonal tests

根據(jù)試驗結(jié)果中的R值可知上樣質(zhì)量濃度對大孔樹脂純化榛子殼棕色素的影響最大，其次為洗脫流量，洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)的影響最小，因此，上樣質(zhì)量濃度為主要因素，洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)為次要因素。根據(jù)分析結(jié)果，作者認(rèn)為最佳因素水平為A3B1C3D2即上樣質(zhì)量濃度為22 mg/mL，上樣流量為1.5 mL/min，洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)為80%，洗脫流量為2.5 mL/min。在此正交試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行了驗證試驗，證明了該條件下榛子棕色素的色價明顯提高，可達(dá)82.6，與試驗中第7個處理的試驗結(jié)果相符。

2.3 純化后的榛子殼棕色素的理化性質(zhì)的研究

2.3.1 二次純化后榛子殼棕色素吸收波長的測定榛子殼中棕色素的含量較為豐富，用上述試驗所確定的最佳純化條件對榛子殼棕色素進(jìn)行分離純化，進(jìn)行純化前后光譜掃描，結(jié)果如圖5所示。

圖5 光譜掃描曲線Fig.5 Spectral scanning curves

由圖5可知，二次純化后的色素溶液在220～380 nm的范圍內(nèi)吸收大大降低，純化后的榛子殼棕色素的純度有了一定程度的提高，但是其最大吸收峰前移，為208 nm，可能是榛子殼棕色素的主要成分被雜質(zhì)覆蓋，在二次純化中去除了榛子殼棕色素一純物中的大量雜質(zhì)，因此其最大吸收峰前移，具體原因有待下一步試驗的研究。

2.3.2 色素的耐光性試驗 榛子殼棕色素耐光性的試驗結(jié)果見圖6。

圖6 光照對色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of light on stability of pigment

由圖6可知，光照對榛子殼棕色素水溶液影響比較小。通過在室內(nèi)散射光、避光處理4 d的榛子殼棕色素，肉眼觀察到色素水溶液顏色沒有發(fā)生改變，在室外自然光處理了4 d的榛子殼棕色素，吸光值略有降低，因此初步判斷榛子殼棕色素具有一定的耐光性，但考慮到榛子殼棕色素的最佳儲存穩(wěn)定性，最好避光保存。

2.3.3 色素的耐熱性試驗 榛子殼棕色素的耐熱性試驗結(jié)果見圖7。

圖7 溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of temperature on stability of pigment

由圖7可知，溫度對榛子殼棕色素的穩(wěn)定性有一定的影響。隨著加熱溫度的提高和加熱時間的延長，色素水溶液的顏色略有加深，但溶液均一穩(wěn)定，無沉淀產(chǎn)生。隨著溫度的升高，色素水溶液的吸光值逐漸提高，但是隨著時間的延長，其吸光值又呈下降趨勢，可能是色素的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化［16］。因此，高溫對榛子殼棕色素的穩(wěn)定性有一定的影響。

2.3.4 色素的耐酸堿性試驗 榛子殼棕色素的耐酸堿性試驗結(jié)果見圖8。

圖8 色素溶液pH值對其穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on stability of pigment

由圖8可知，色素溶液的pH對榛子殼棕色素的穩(wěn)定性有一定的影響。隨著色素溶液pH的增加，色素溶液的吸光值呈增大趨勢，且顏色逐漸加深，但是隨著處理時間的延長，其吸光值有所下降；在酸性條件下，其吸光值比較穩(wěn)定，但是其顏色略微變淺，呈淺褐色，可能是因為pH的變化，造成了色素的分解［17-18］，進(jìn)而影響色素溶液的顏色及其吸光值，因此色素溶液的pH對其穩(wěn)定性有一定的影響，至于色素溶液的pH對色素穩(wěn)定性的影響機制，需進(jìn)一步試驗的研究。

2.3.5 金屬離子對色素的穩(wěn)定性的影響試驗 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響試驗結(jié)果如表4所示。

表4 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響Table4 Effect of metal ions on stability of pigment

由表4可知，榛子殼棕色素對試驗中的部分金屬離子比較穩(wěn)定，但是對Fe3+，Cu2+，Al3+，Zn2+比較敏感，尤其是 Fe3+，使榛子殼棕色素的吸光值明顯增加，同時有沉淀產(chǎn)生，因此，在使用及保存榛子殼棕色素的過程中，應(yīng)避免與鐵制品，銅制品，鋁制品，鋅制品接觸。

2.3.6 色素的著色力試驗 色素的著色力試驗結(jié)果如表5所示。榛子殼棕色素對淀粉類有良好的著色力，對禽蛋類，肉類，豆類也有較好的著色力，但是對油料類的著色力較差，對殘留液測定吸光值，其結(jié)果與感官結(jié)果相符合，因此，榛子殼棕色素更適用于淀粉類，禽蛋類及肉類食品的著色。

表5 色素對不同種類的食物的著色力Table5 Coloring power of pigment on different types of food

3 討論與結(jié)論

經(jīng)試驗可知，用D101大孔樹脂對榛子殼棕色素進(jìn)行二次分離純化的最佳工藝條件為：上樣質(zhì)量濃度為22 mg/mL，上樣流量為1.5 mL/min，洗脫劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)為80%，洗脫流量為2.5 mL/min。經(jīng)D101二次分離純化的榛子殼棕色素，色價從44.0提高到了82.6。試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上樣濃度小時，樹脂的飽和吸附量低，影響了樹脂的工作效率，但是上樣濃度過大時，樹脂的飽和吸附量會下降，因此，應(yīng)該通過試驗選擇最佳的上樣質(zhì)量濃度；但是對于質(zhì)量濃度對吸附的影響，文獻(xiàn)報道不盡相同，尹忠平等［10，19］認(rèn)為濃度越大對吸附越有利；而陳守江等［20］認(rèn)為濃度的影響不大；上官新晨等認(rèn)為質(zhì)量濃度越低越好，這可能是各個試驗的條件和色素性質(zhì)不同引起的［21］。

對純化后的榛子殼棕色素的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，該色素耐光性好，高溫、色素溶液的pH對該色素的穩(wěn)定性有一定的影響；Na+、Mg2+、K+、Ca2+對其穩(wěn)定性影響小，F(xiàn)e3+、Cu2+、Al3+、Zn2+對其穩(wěn)定性有破壞作用；該色素對淀粉類、禽蛋類、肉類食品的著色性良好。除此之外，試驗中發(fā)現(xiàn)，榛子殼棕色素對低濃度的H2O2有一定的耐受性，但是對亞硫酸氫鈉的耐受性較差。

溫度對色素穩(wěn)定性的影響的研究中，大部分試驗結(jié)果表明，溫度的升高增加了色素的降解作用，色素的吸光值呈現(xiàn)降低趨勢［22-24］，作者試驗中發(fā)現(xiàn)，榛子殼棕色素的吸光值隨著溫度的升高呈現(xiàn)了增大的趨勢，并且對榛子殼棕色素有一定的增色作用，更有利于其在食品加工中的應(yīng)用，關(guān)于其增色的機理，尚需進(jìn)一步研究。

對于溶液pH對色素穩(wěn)定性的影響，大部分試驗結(jié)果表明，棕色素在堿性條件下顏色加深，且吸光值有所波動，在酸性條件下，吸光值更加穩(wěn)定；如周萍等［25］對泡核桃殼棕色素的研究發(fā)現(xiàn)，溶液pH小于6.0時，色素吸光值保持穩(wěn)定，溶液pH大于6.0時，色素的吸光值隨pH的增大而增大；肖凱軍等［26］對金櫻子棕色素的研究發(fā)現(xiàn)，色素溶液吸光值隨色素溶液的pH增大而升高，這與作者研究結(jié)果相似；也有一部分試驗的結(jié)果表明，棕色素在堿性條件下的吸光值更加穩(wěn)定［27］；如李莉?qū)Π謇鯕ぷ厣氐姆€(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn)，色素溶液在pH為3～7時，其吸光值變化很大，在pH為7～10時，其吸光值比較穩(wěn)定；但是關(guān)于pH對色素穩(wěn)定性影響的機理研究未見報道。

在色素溶液中添加了FeCl3、CuSO4水溶液后，分別生成了墨綠色及磚紅色的沉淀，說明該色素有較強的還原能力，因此在食品加工過程中，可以與抗氧化劑協(xié)同，或者可以作為天然抗氧化劑，利于其在食品加工中的應(yīng)用。

目前，對于棕色素對不同種類的食物的著色力的研究鮮有報道，作者試驗中發(fā)現(xiàn)，榛子殼棕色素對淀粉類、肉類等有良好的著色力，因此，可以將該色素揉進(jìn)面團里，制作棕色饅頭，也可以用榛子殼棕色素溶液浸泡大米，肉類等，對其著色，增加人們的食欲的同時還有保健作用。

目前已有人在研究榛子殼棕色素的穩(wěn)定性及其抗氧化性［28］，這說明純化后的榛子殼棕色素不僅可以作為天然色素使用，還有可能在醫(yī)學(xué)，食品，化妝品行業(yè)發(fā)揮廣泛作用。

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Purification and Characterization of Brown Pigment from Hazelnut Shells

WANG Jinling， YAO Limin， KUANG Hui
（School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

On the basis of the preparatory purification of brown pigment from hazelnut shells with macroporous resin，the further purification with D101 resin was studied through single-factor and orthogonal experiments.The optimal parameters were found to be sample concentration of 22 mg/mL，velocity of 1.5 mL/min，eluting ethanol of 80%and velocity of 2.5 mL/min，which resulted in an increase of color value of the pigment from 44 to 82.6.The high temperature and the solution pH affected the stability of obtained brown pigment but light had no effect；fetal ions Fe3+，Cu2+，Al3+and Zn2+decreased its stability but Na+，Mg2+，Ca2+and K+had no effects；it efficiently colored starchy foods，eggs and meet.

hazelnut shells，brown pigment，purification，physicochemical properties

TS 202.3

A

1673—1689（2016）07—0770—08

2015-01-12

黑龍江省青年科學(xué)基金項目（QC2012C118）。

王金玲（1975—），女，黑龍江綏化人，工學(xué)博士，副教授，主要從事天然活性物質(zhì)研究。E-mail：wangjinling08@163.com