一株深海真菌FS86的分離鑒定及其生物活性研究

吳后呂李浩華譚國慧陳玉嬋劉運美章衛(wèi)民

（1. 南華大學(xué)藥物藥理研究所，衡陽 421001；2. 廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣州 510070）

一株深海真菌FS86的分離鑒定及其生物活性研究

吳后呂1，2李浩華2譚國慧2陳玉嬋2劉運美1章衛(wèi)民2

（1. 南華大學(xué)藥物藥理研究所，衡陽 421001；2. 廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣州 510070）

采用平板涂布法從南海深海沉積物中分離出一株真菌FS86，根據(jù)培養(yǎng)特征、形態(tài)學(xué)特征和ITS序列分析，該菌株被鑒定為球孢枝孢（Cladosporium sphaerospermum）。生物活性測試結(jié)果表明，其發(fā)酵提取物對8種病原真菌和4種腫瘤細(xì)胞株都具有明顯的抑制作用，其MIC值和IC50值分別為0.1-4 mg/mL和0.86-2.13 μg/mL。

深海真菌；球孢枝孢；分離；鑒定；抗真菌；細(xì)胞毒

深海是全球最大的獨立生態(tài)系統(tǒng)，生活于深海的海洋微生物處于獨特的物理、化學(xué)和生態(tài)環(huán)境中，形成了特殊的遺傳機制和代謝系統(tǒng)，使深海微生物能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性獨特的次級代謝產(chǎn)物。因此，深海微生物具有重要的研究和應(yīng)用價值，可為開發(fā)新的生物活性物質(zhì)提供優(yōu)異的種質(zhì)資源［1-3］。海洋真菌是海洋微生物的重要組成部分，具有巨大的開發(fā)潛力［4］。為了發(fā)掘深海真菌活性次級代謝產(chǎn)物，本課題組前期對分離自南海沉積物的深海真菌進行培養(yǎng)條件優(yōu)化、活性篩選和化學(xué)篩選，發(fā)現(xiàn)菌株FS86具有生長速度快、代謝產(chǎn)物豐富、抗真菌活性強等特點。本研究以該菌株為研究對象，根據(jù)其培養(yǎng)特征和形態(tài)特征及ITS序列分析對該菌株進行鑒定，并測試其發(fā)酵提取物對病原真菌和腫瘤細(xì)胞株的抑制活性，旨在為進一步開發(fā)新的抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 菌株FS86分離自南海（12°58.551' E，17° 0.646' N）1598 m深處的海洋沉積物。

1.1.2 供試菌株及腫瘤細(xì)胞株 病原真菌：白色念珠菌（Candida albicans）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、綠色木霉（Trichoderma viride）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、柱枝雙孢霉（Cylindrocladium scoparium）、新月彎孢菌（Curvularia lunata）、鏈格孢（Alternaria alternata）。腫瘤細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞株NCI-H460、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SF-268、人肝癌細(xì)胞株HepG-2。以上菌株和腫瘤細(xì)胞株均保存于廣東省微生物研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：含3%粗海鹽的PDA培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖10 g、甘露醇20 g、酵母膏3 g、蛋白胨5 g、味精5 g、粗海鹽3 g，水1 L。病原真菌采用PDA培養(yǎng)基；腫瘤細(xì)胞株采用RPMI-1640培養(yǎng)基。

1.1.4 試劑 二甲基亞砜（DMSO），Sulforhodamine B sodium salt（SRB），均購自Sigma公司；三氯醋酸（分析純），廣州化學(xué)試劑一廠；RPMI-1640培養(yǎng)基，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.1.5 儀器 PYX-DHS電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石醫(yī)療器械廠；YXQ.WY21-600電熱高壓蒸汽滅菌鍋，廣州市華南醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺，上海恒益科技有限公司；RE-2000旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱，Shellab公司；DMI3000B倒置顯微鏡，Leica公司；MULTISKAN GO全波長酶標(biāo)儀，Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 無菌操作取適量海洋沉積物樣品用含3%粗海鹽的無菌水稀釋到10%，28℃振蕩20 min，取0.1 mL均勻涂布在分離培養(yǎng)基中，28℃恒溫箱培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取平板中單一菌落轉(zhuǎn)接至含有新鮮分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)多次分離純化直至獲得純菌株后，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)3-5 d 后保存于4℃冰箱。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征 將菌株FS86接種于PDA培養(yǎng)基平板上，28℃下培養(yǎng)7 d，肉眼觀察菌株的培養(yǎng)特征；利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察其菌絲、分生孢子梗、分生孢子等形態(tài)特征。

1.2.2.2 ITS序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析 采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，作為PCR擴增的模板。PCR擴增采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA ITS）通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，正向）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，反向）擴增分離菌株的rDNA ITS區(qū)。PCR采用20 μL 反應(yīng)體系，通過Ex Taq（TaKaRa）進行。反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性3 min；93℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。獲得的序列通過BLAST程序在GenBank上進行相似性序列檢索，下載相關(guān)序列，以Cercospora beticola CBS 124.31（KF251298）為外類群，運用MEGA 5軟件通過鄰接法（Neighbor-Joining），構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 設(shè)置為1 000次重復(fù)。

1.2.3 菌株的發(fā)酵與提取物的制備 將菌株FS86接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，120 r/min 培養(yǎng)7 d后將發(fā)酵產(chǎn)物用乙酸乙酯冷浸提取多次至提取液基本無色，合并提取液，經(jīng)55℃下減壓濃縮至干，得發(fā)酵提取物。將提取物浸膏用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成50 mg/mL濃度，備用。

1.2.4 抗菌活性測定 取對數(shù)生長期的白色念珠菌用生理鹽水稀釋至濃度為106CFU/mL的菌液；其它真菌調(diào)整至孢子數(shù)為106個/mL的孢子懸液，吸取制備好的菌液或孢子懸浮液1 mL于培養(yǎng)皿中，倒入已冷卻至合適溫度的PDA培養(yǎng)基，混合均勻，用無菌鑷子夾取厚度為1.5 mm、直徑為6 mm的濾紙片置于含菌平板上，在濾紙片上分別滴加提取液5 μL作為樣品組，以DMSO代替發(fā)酵提取液作為空白對照組，以制霉菌素作為陽性對照，將平板置于28℃恒溫箱培養(yǎng)72 h，用十字測量法測量抑菌圈直徑的大小。

1.2.5 最低抑菌濃度的測定 將提取物溶液用DMSO分別稀釋至濃度為4、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05mg/mL。按1.2.4方法測定，觀察濾紙片周圍的抑菌圈，以周圍有抑菌圈的濾紙片所含樣品的最低溶液濃度為最低抑菌濃度（MIC值）。

1.2.6 細(xì)胞毒活性測定 采用SRB法［5］測定提取物對腫瘤細(xì)胞毒活性：取對數(shù)生長期的NCI-H460、SF-268、MCF-7、HepG-2細(xì)胞，用胰酶消化，臺盼藍染色計數(shù)，臺盼藍排斥實驗檢測細(xì)胞活力大于95%后，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3 × 104個/mL，細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入180 μL的細(xì)胞懸液，并設(shè)空白孔調(diào)零，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20 μL待測樣品，陰性對照加20 μL培養(yǎng)基，以順鉑作陽性對照。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入50 μL 50%冷三氯醋酸固定細(xì)胞，4℃放置1 h 后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后每孔加入由1%冰醋酸配制的濃度為4 mg/mL的SRB溶液100 μL，室溫中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后每孔加入濃度為10 mmol/mL的Tris 溶液200 μL，用酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度（A）值，按以下公式計算提取物對細(xì)胞生長的抑制率，采用SigmaPlot 10.0 軟件計算IC50值。

細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-A樣品組/藥物組/A陰性組）×100%。

2 結(jié)果

2.1 菌株FS86的鑒定

2.1.1 菌株培養(yǎng)特征與形態(tài)特征 菌株FS86在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d，直徑達35 mm，菌落正面橄欖褐色，有輻射狀溝紋，中央稍隆起，邊緣白色，絨毛狀；菌落背面灰黑色。菌絲有隔，粗3-5 μm，分生孢子梗直立或稍彎曲，分枝或不分枝，圓柱形，（60-165）μm×（3-5）μm，具分隔；枝孢圓柱形或紡錘形，（7-21）μm×（3-3.5）μm，具1-4個分隔；分生孢子黃褐色至橄欖褐色，球形、近球形或卵圓形，（3.5-6.3）μm×（3.1-4.2）μm，單孢，表面具疣突，孢臍明顯（圖1）。參照Bensch等［6］的分類系統(tǒng)，菌株FS86鑒定為球孢枝孢（Cladosporium sphaerospermum）。

2.1.2 ITS序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序獲得的序列信息提交至GenBank，登錄號為KF294264。BLAST結(jié)果顯示，菌株FS86與C. sphaerospermum ATCC MYA-4645（HQ263345）的相似度為99.4%。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）看，菌株FS86與4條C. sphaerospermum序列聚為高度自展支持的一支，彼此間遺傳距離極小。因此，通過分子系統(tǒng)學(xué)分析確定菌株FS86為球孢枝孢。

2.2 抗菌活性

從表1和圖3可以看出，菌株FS86的發(fā)酵提取物對8種病原真菌都具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均達30 mm以上；其中對白色念珠菌的抑制作用最為顯著，抑菌圈直徑達45.2 mm，對黑曲霉和黃曲霉的抑菌圈直徑為40 mm左右，對其他病原真菌的抑菌圈直徑為30-37 mm。

2.3 最低抑制濃度

通過菌株FS86的發(fā)酵提取物對8種供試真菌最低抑制濃度的測試，結(jié)果（表2）顯示該提取物對白色念珠菌和新月彎孢霉的最低抑制濃度（MIC值）僅為0.1和0.25 mg/mL，對其他真菌的最低抑制濃度為1-4 mg/mL。

2.4 細(xì)胞毒活性

菌株FS86發(fā)酵提取物的細(xì)胞毒活性測試結(jié)果（表3）顯示，該提取物對4種腫瘤細(xì)胞株SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2均表現(xiàn)出很強的細(xì)胞毒活性，其中對MCF-7的抑制效果優(yōu)于陽性對照藥物順鉑，IC50值僅為0.86 μg/mL，對其它細(xì)胞株的IC50值均接近陽性對照藥物，IC50值為1.42-2.13 μg/mL。

圖1 菌株FS86的培養(yǎng)特征及掃描電鏡下的形態(tài)特征

圖2 菌株FS86與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 菌株FS86發(fā)酵提取物對病原真菌的抑制作用（±s，n=3）

表1 菌株FS86發(fā)酵提取物對病原真菌的抑制作用（±s，n=3）

注：樣品組每片濾紙含提取物250 μg，陽性對照每片濾紙含制霉菌素10 μg；“N”表示未設(shè)陽性對照

供試菌抑菌圈直徑/mm FS86提取物陽性對照白色念珠菌45.2±0.20 25.5±0.63黑曲霉41.0±0.72 30.2±0.55黃曲霉40.2±0.63 15.5±0.11綠色木霉30.8±1.21 21.9±0.31膠孢炭疽菌36.8±1.64 N柱枝雙孢霉35.2±0.68 N新月彎孢霉30.5±0.22 N鏈格孢30.1±0.76 N

圖3 菌株FS86對病原真菌的抑制效果

3 討論

枝孢屬（Cladosporium）真菌種類繁多，分布廣泛［4］。研究表明，枝孢屬真菌的代謝產(chǎn)物具有多種生物活性，是尋找活性物質(zhì)的重要資源。如分離自芽枝狀枝孢（C. cladosporioides）的枝孢菌素（Cladosporin）對紅蜘蛛、蚜蟲和紛殼蟲等害蟲有較強的毒殺作用［7，8］；來源于植物的芽枝狀枝孢還能產(chǎn)生石杉堿甲、紫杉醇等活性物質(zhì)［9，10］；分離自栓皮櫟的枝孢菌（C. sp. I（R）9-2）能產(chǎn)生抗真菌活性的布雷菲爾德菌素（Brefeldin A）［11］，該細(xì)胞毒素還具有抗腫瘤、抗病毒、抗有絲分裂等活性［12］；從銀杏中分離的尖孢枝孢（C. oxysporum R2）其發(fā)酵粗提物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有明顯的抑制作用［13］。目前，關(guān)于海洋來源的枝孢屬真菌活性代謝產(chǎn)物的報道還不多，Shigemori等［14］從分離自海藻的枝孢菌（C. sp. L037）中分離得到12元大環(huán)內(nèi)酯sporiolides A，它對新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）和粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）具有抑菌活性；林濤等［15］從分離自?？诩t樹林泥土的球孢枝孢（C. sphaerospermum PJX-41）中分離得到2個具有抗腫瘤活性的喹唑啉酮生物堿類化合物lapatin A和tryptoquivaline；Wu等［16］從太平洋深海來源的球孢枝孢（C. sphaerospermum 2005-01-E3）中發(fā)現(xiàn)化合物Cladosin C對流感病毒A H1N1具有抑制活性。本研究發(fā)現(xiàn)來源于南海深海沉積物的球孢枝孢（C. sphaerospermum FS86）發(fā)酵提取物具有明顯的抗真菌和細(xì)胞毒活性，因此該菌株具有重要的研究價值，其活性代謝產(chǎn)物有待進一步深入研究，以期開發(fā)出新型的抗真菌和抗腫瘤活性物質(zhì)。

表2 菌株FS86提取物對病原真菌的最低抑制濃度（MIC值）（n=3）

表3 菌株FS86發(fā)酵提取物對腫瘤細(xì)胞株的IC50值（±s，n=3）

表3 菌株FS86發(fā)酵提取物對腫瘤細(xì)胞株的IC50值（±s，n=3）

樣品IC50/（μmol·L-1）SF-268MCF-7NCI-H460HePG-2發(fā)酵提取物2.13±0.310.86±0.121.95±0.001.42±0.34順鉑2.51±0.031.36±0.191.33±0.851.75±0.21

4 結(jié)論

本研究通過形態(tài)學(xué)和ITS系統(tǒng)發(fā)育分析，將深海真菌FS86鑒定為球孢枝孢（C. sphaerospermum）。經(jīng)抗菌活性測試發(fā)現(xiàn)，該菌株的發(fā)酵提取物對所有的供試真菌均有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均達30 mm以上，其中對白色念珠菌的抑制活性尤其顯著，其最低抑制濃度（MIC值）為0.1 mg/mL；經(jīng)細(xì)胞毒活性測試發(fā)現(xiàn)，該菌株的發(fā)酵提取物對供試的4種腫瘤細(xì)胞有顯著的抑制活性，其中對細(xì)胞株MCF-7的活性尤為顯著，其IC50值為0.86 μmol/L，低于陽性對照藥物順鉑。

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（責(zé)任編輯李楠）

Isolation and Identification of a Deep-sea-derived Fungus FS86 and Its Biological Activities

WU Hou-lü1，2LI Hao-hua2TAN Guo-hui2CHEN Yu-chan2LIU Yun-mei1ZHANG Wei-min2
（1. Institute of Pharmacy and Pharmacology，University of South China，Hengyang 421001；2. State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070）

A strain of fungus FS86 was isolated from deep-sea sediment of South China Sea by the spread plate method. According to the culture features， morphological characteristics and ITS sequence analysis， the strain was identified as Cladosporium sphaerospermum. Bioassay results showed that the fermentation extract of the strain FS86 demonstrated significant inhibitory effects against 8 pathogenic fungi and 4 tumor cell lines with MICs of 0.1-4 mg/mL and IC50values of 0.86-2.13 μg/mL， respectively.

deep sea fungus；Cladosporium sphaerospermum；isolation；identification；antifungal；cytotoxic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.031

2015-05-08

國家自然科學(xué)基金項目（31272087），國家“863”計劃資助項目（2012AA092104），廣東省自然科學(xué)基金項目（S20130100145 57），廣州市科技計劃項目（2013J4100067），廣東省海洋經(jīng)濟創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范專項項目（GD2012-D01-002）

吳后呂，男，碩士研究生，研究方向：海洋微生物活性代謝產(chǎn)物；E-mail：four_square@163.com

章衛(wèi)民，男，博士，研究員，研究方向：藥用微生物資源及其活性物質(zhì)；E-mail：wmzhang58@qq.com