2013～2014年平頂山市流感病毒實驗室檢測結(jié)果分析

王慧晶，李艷艷，李軍偉，孫南葉

（平頂山市疾病預(yù)防控制中心，河南467000）

2013～2014年平頂山市流感病毒實驗室檢測結(jié)果分析

王慧晶，李艷艷，李軍偉，孫南葉

（平頂山市疾病預(yù)防控制中心，河南467000）

目的分析平頂山市2013～2014年流感病毒實驗室檢測結(jié)果，及時掌握流感病毒類型，為防控工作提供依據(jù)。方法采用實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)對哨點醫(yī)院（平頂山市第一人民醫(yī)院）采集的流感樣病例標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測，并用狗腎傳代細(xì)胞（MDCK），通過血凝、血抑實驗分離毒株。結(jié)果2013～2014年共檢測流感樣病例標(biāo)本1 296例，陽性標(biāo)本231例，總陽性率為17.82%。2013年陽性標(biāo)本主要集中在1～3月，以新甲型H1N1型流感病毒為主；且11～12月為高發(fā)時期，B型流感病毒為絕對優(yōu)勢毒株。2014年陽性標(biāo)本主要集中在1～3月，以新甲型H1N1型流感病毒為主；且8～12月為高發(fā)時期，季節(jié)性H3型流感病毒為唯一檢出類型。2013～2014年共分離出32株毒株，其中B型Yamagata系7株，新甲型H1N1型1株，季節(jié)性H3型24株。結(jié)論應(yīng)及時分析流感病毒特征及流行趨勢，盡力避免流感大流行的發(fā)生。

正黏病毒科/分離和提純；實驗室；流感病毒B型；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；病毒分離

流行性感冒簡稱流感，是一種由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，具有潛伏期短、傳播能力強(qiáng)的特征。流感病毒分甲、乙、丙3型，為單股、負(fù)鏈、分節(jié)段RNA病毒。甲型流感病毒主要的表面抗原有2種，分別為血凝素和神經(jīng)氨酸酶，均易發(fā)生變異造成流行，對人類健康危害極大[1-3]。加強(qiáng)流感病毒的監(jiān)測，及時了解、掌握病毒特征及流行趨勢，對流感疫情的防控工作具有重要意義?，F(xiàn)將平頂山市2013～2014年流感病毒實驗室檢測結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 參照全國流感監(jiān)測方案[4]，采集2013～2014年哨點醫(yī)院（平頂山市第一人民醫(yī)院，是衛(wèi)生部加強(qiáng)流感監(jiān)測所設(shè)的流感監(jiān)測定點醫(yī)院）流感樣患者的鼻咽拭子標(biāo)本，于4℃條件下保存，48 h內(nèi)送實驗室檢測。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理 將標(biāo)本15 mL于離心管震蕩20 min混勻，以洗下拭子上黏附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等。在生物安全柜下分裝為3份，其中2份于-70℃凍存，1份吸取1 mL樣品待檢。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）所有標(biāo)本采用實時熒光定量RT-PCR方法檢測。其中，核酸的提取采用天隆NP968磁珠核酸提取儀；核酸擴(kuò)增根據(jù)流感病毒核酸檢測試劑盒說明書的操作要求進(jìn)行反應(yīng)體系配置，使用BIO-RAD CFX96多重實時熒光定量RT-PCR儀收集熒光信號，進(jìn)行結(jié)果判定。

1.2.2.2 病毒分離 采用狗腎傳代細(xì)胞（MDCK）培養(yǎng)法分離流感病毒，每天觀察細(xì)胞病變情況，當(dāng)75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時進(jìn)行收獲。即使無細(xì)胞病變也應(yīng)于第7天收獲。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗（HA），并以紅細(xì)胞凝集抑制試驗（HI）鑒定流感病毒毒株。

2 結(jié) 果

2.1 流感病毒核酸檢測結(jié)果 2013～2014年共檢測流感樣病例標(biāo)本1 296例，陽性標(biāo)本231例，總陽性率為17.82%，其中季節(jié)性H3型陽性比例最高，為42.86%。2013年的流行毒株為B型，占陽性標(biāo)本的55.91%；2014年以季節(jié)性H3型為主，占陽性標(biāo)本的64.49%，并檢測出1例新甲型H1N1型和B型混合感染。見表1。

表1 平頂山市2013～2014年流感病毒核酸檢測結(jié)果[n（%）]

2.2 2013年不同月份流感病毒核酸檢測結(jié)果 2013年流感病毒陽性主要集中于2個時期。第1個時期是在1～3月，以新甲型H1N1型流感病毒為主∶共檢測標(biāo)本132例，新甲型H1N1型檢出30例，季節(jié)性H3型檢出7例，未檢測到其他類型；第2個時期是在11～12月，主要以B型流感病毒為主∶共檢測標(biāo)本178例，B型檢出51例，季節(jié)性H3型檢出3例，新甲型H1N1型檢出1例。見圖1。

圖1 2013年不同月份流感病毒核酸檢測情況

2.3 2014年不同月份流感病毒核酸檢測結(jié)果 2014年流感病毒陽性仍然集中于2個時期。第1個時期是在1～3月，以新甲型H1N1型流感病毒為主∶共檢測標(biāo)本260例，新甲型H1N1型檢出29例，B型檢出19例，季節(jié)性H3型檢出17例，并在1月檢測出1例混合型，為A（H1N1）型和B型混合感染；1月延續(xù)了2013年12月的B型檢出高峰，在94例標(biāo)本中檢出B型19例，同時新甲型H1N1型檢出率迅速升高，檢出新甲型H1N1型20例，并成為1～3月的流行類型。

2014年流感高峰較2013年發(fā)生提前，在8月份就檢出12例季節(jié)性H3型，并成為8～12月的唯一檢出類型，也成為該季節(jié)的絕對流行毒株。由此，第2個時期是在8～12月∶共檢測標(biāo)本354例，檢出季節(jié)性H3型72例。表明流感的發(fā)病率具有明顯的季節(jié)性，并且各類型交替出現(xiàn)。見圖2。

2.4 流感病毒分離情況 2013～2014年共檢出231例核酸陽性標(biāo)本，從中分離出流感病毒毒株32株，分離率為13.85%。其中2013年檢出的93例核酸陽性標(biāo)本中分離出7株流感病毒毒株，分離率為7.53%，均來自于12月份采集的標(biāo)本，毒株均為B型Yamagata系。2014年檢出的138例核酸陽性標(biāo)本中分離出25株流感病毒毒株，分離率為18.12%，其中4月分離出1株新甲型H1N1型；10月分離出3株季節(jié)性H3型；12月分離出21株季節(jié)性H3型。

圖2 2014年不同月份流感病毒核酸檢測情況

3 討 論

流感病毒具有發(fā)生突然、蔓延迅速的流行特點，可造成不同程度的流行。流感病毒的抗原易發(fā)生變異，包括抗原性漂移和抗原性轉(zhuǎn)變2種形式。當(dāng)一種新型變異株出現(xiàn)時，由于人群普遍缺少針對性的特異性免疫，故均易感染[5-7]。流感病毒的不斷變異是對人類健康的巨大挑戰(zhàn)，如近幾年出現(xiàn)的H5N1、H7N9，造成禽類與人流感病毒間的傳播，充分表明要始終以發(fā)展的眼光看待流感病毒的檢測工作，及時、準(zhǔn)確地掌握流感病毒的類型，做好疫情的防控工作。

2013～2014年檢測的1 296例流感樣病例標(biāo)本中包括3種流感病毒類型，即B型、季節(jié)性H3型、新甲型H1N1型，未出現(xiàn)流感亞型的變異。2013～2014年流感病毒類型為交替出現(xiàn)，2013年1～3月以新甲型H1N1型為優(yōu)勢毒株；至11～12月B型流感病毒成為絕對優(yōu)勢毒株。2014年1～3月以新甲型H1N1型流行為主，8～12月以季節(jié)性H3型為唯一檢出類型，成為該季節(jié)的絕對流行毒株。流感病毒的類型和流行趨勢處于相對平穩(wěn)的狀態(tài)，未發(fā)現(xiàn)有較大規(guī)模的流行和新型變異株的出現(xiàn)。但2014年流感病毒陽性率有所提高，達(dá)19.69%，流行月份明顯提前。所以應(yīng)加強(qiáng)流感的日常監(jiān)測工作，防止流感疫情的暴發(fā)。

MDCK培養(yǎng)法相對其他病毒分離培養(yǎng)方法具有經(jīng)濟(jì)、方便、分離率高的特征，抗原性更接近于自然流行株，有助于疫苗的生產(chǎn)[8-10]。本研究通過MDCK培養(yǎng)法從流感樣病例標(biāo)本中成功分離出32株流感病毒毒株，但大部分陽性標(biāo)本未能分離出流感病毒，說明在檢測流感病毒時應(yīng)首先考慮采用實時熒光定量RT-PCR檢測方法，及時檢出病原，以利于全面地掌握流感流行特征。同時應(yīng)加強(qiáng)病毒分離方法的質(zhì)量控制，積累細(xì)胞培養(yǎng)分離的經(jīng)驗，及時發(fā)現(xiàn)病毒抗原性、基因特性等變異并做出預(yù)警，盡力避免流感大暴發(fā)。

[1]郭元吉，趙惠芬，王敏，等.流感病毒相變的發(fā)現(xiàn)及其意義[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，1996，10（2）∶101-103.

[2]汪強(qiáng)，李向東，彭焱，等.重慶市渝中區(qū)2011-2012年2所流感哨點監(jiān)測醫(yī)院流感樣病例監(jiān)測結(jié)果分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，30（5）∶679-680.

[3]杜銀菊，劉莉，徐可心，等.2009年-2012年聊城市國家級流感網(wǎng)絡(luò)實驗室病原學(xué)檢測結(jié)果分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2013，23（9）∶2139-2141.

[4]中國疾病預(yù)防控制中心.中國疾病預(yù)防控制中心關(guān)于印發(fā)全國流感監(jiān)測技術(shù)指南的通知[S].2011-08-09.

[5]崔薇，劉紅，初秋，等.長春市2012-2013年流感病毒核酸監(jiān)測結(jié)果分析[J].中國實驗診斷學(xué)，2013，17（10）∶1859-1861.

[6]宋紹霞，林藝，王宇路，等.2005-2011年山東省流行性感冒監(jiān)測結(jié)果與分析[J].疾病監(jiān)測，2012，27（1）∶42-45.

[7]楊晉川，童晶，張傳玲，等.2005-2011年徐州市流感病原學(xué)監(jiān)測結(jié)果分析[J].中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2012，26（6）∶412-414.

[8]郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其實驗技術(shù)[M].北京∶中國三峽出版社，1997∶94.

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[10]李博，黃銳敏.深圳市南山區(qū)2010-2013年流感病原學(xué)檢測結(jié)果分析[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2014，14（4）∶462-464.

Analysis on laboratory test results of influenza virus in Pingdingshan city during 2013-2014

Wang Huijing，Li Yanyan，Li Junwei，Sun Nanye
（Pingdingshan Municipal Center for Disease Control and Prevention，Henan 467000，China）

ObjectiveTo analyze the laboratory test results of influenza virus in Pingdingshan city during 2013-2014 for timely mastering the influenza virus types to provide a basis for its prevention and control work.MethodsThe throat swabs were collected from the suspected influenza-like cases from the sentinel hospital and performed the nucleic acid detection by the real-time RT-PCR.MDCK was used.The isolated virus was identified by hemagglutination test（HA）and hemagglutination inhibition test（HI）.ResultsThe 1 296 specimens collected from the suspected influenza-like cases were detected in 2013-2014，the positive specimens were 231 cases with the total positive rate of 17.82%.The positive specimens in 2013 mainly concentrated in January to March and was dominated by new influenza A（H1N1）virus，its high epidemic period was from November to December，B type influenza virus was the absolutely predominant strain.The positive specimens during 2014 were mainly concentrated in Jan uary-March，newinfluenzaA（H1N1）viruswaspredominantstrain，moreoverthehigh epidemicperiod wasfrom AugusttoDecember and influenza A（H3）virus was the only strain type detected in this period.A total of 32 influenza virus strains were isolated during 2013-2014，including 7 strain of B Yamagata，1 strain of new A （H1N1）and 24 strains of seasonal H3.ConclusionShould timely analyze the characteristics of influenza virus and epidemic trend and try best to avoid influenza pandemic occurrence.

Orthomyxoviridae/isolation&purification；Laboratories；Influenza B virus；Reverse transcriptase polymerase chain reaction；Real-time fluorescent quantitative reverse transcription；Virus isolation

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.13.009

：A

：1009-5519（2015）13-1950-02

∶2015-03-12）

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本刊編輯部

∶王慧晶（1982-），女，山東威海人，碩士研究生，主管技師，主要從事微生物檢驗方面的研究；E-mail∶hjwang25@163.com。