閆　超，蘇彩霞，劉曉紅，李海濤，安　安（河南省新鄭市紅棗科學(xué)研究院，河南　新鄭　451100）

灰棗田間愈傷組織誘導(dǎo)多倍體的育種方法研究

閆超，蘇彩霞，劉曉紅，李海濤，安安
（河南省新鄭市紅棗科學(xué)研究院，河南新鄭451100）

以灰棗為試材，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、截干高度、覆蓋方式、AgNO3濃度、二甲基亞砜及秋水仙素濃度對(duì)愈傷組織形成和不定芽形成的影響，獲得一套適合灰棗田間誘導(dǎo)多倍體的育種方法。

灰棗；愈傷組織；誘變；四倍體

多倍體是指體細(xì)胞中含有3個(gè)或3個(gè)以上染色體組（Genome）的個(gè)體，是植物最重要的進(jìn)化方式之一［1］。目前，田間棗樹莖尖誘變和組培條件下胚性細(xì)胞誘變均已取得明顯進(jìn)展。但莖尖誘變后，多獲得嵌合體，分離純化所需周期長(zhǎng)；組培條件下通過胚狀體途徑雖可快速獲得純合多倍體，但仍存在從組培苗煉苗下地到開花結(jié)果周期長(zhǎng)的問題［2-5］。因此，在田間誘導(dǎo)胚性愈傷組織獲得純合多倍體是一項(xiàng)更為理想的技術(shù)方法，不僅可以快速誘導(dǎo)獲得純合多倍體，而且加倍不定芽當(dāng)年可發(fā)育形成木質(zhì)化枝條，用于嫁接擴(kuò)繁，可大大縮短多倍體育種周期，同時(shí)可徹底解決嵌合體純化難題［6］。

棗樹多倍體與二倍體相比具有更高水平的雜合性，常帶來一些形態(tài)和生理上的變化，在增大果個(gè)、提高生長(zhǎng)速度、增進(jìn)遺傳品質(zhì)以及提高目的代謝物含量等方面具有優(yōu)勢(shì)。因此，灰棗多倍體育種能夠增加新品種的數(shù)量，大大提高棗品種的質(zhì)量，對(duì)解決目前新鄭紅棗普遍出現(xiàn)果個(gè)小、色澤差、含糖量和其它營(yíng)養(yǎng)成分下降等問題，滿足生產(chǎn)者和消費(fèi)者需求具有重要意義。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

大田所用試驗(yàn)材料為優(yōu)良鮮食制干兼用棗品種灰棗（新鄭市紅棗科學(xué)研究院試驗(yàn)園）。

1.2試驗(yàn)方法

采用枝干短截的方法，把灰棗樹處理成樹樁，每棵樹短截的枝干數(shù)以5～7個(gè)枝為佳，同時(shí)留取1 ～2個(gè)輔養(yǎng)枝，去除其余細(xì)小枝條。用脫脂棉繞截面形成層覆蓋1圈，將誘導(dǎo)愈傷的藥液滴加在脫脂棉上，以浸濕脫脂棉為佳，覆蓋處理。

1.2.1不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)形成愈傷的影響

處理灰棗樹枝干，滴加7個(gè)處理藥液 （清水、2，4-D、ZT、TDZ、NAA、TDZ與TBA、ZT與NAA），將脫脂棉充分浸濕，每個(gè)處理25個(gè)枝，覆蓋泥和黑色塑料袋，15 d后觀察愈傷形成。

1.2.2截干的不同高度對(duì)形成愈傷的影響

處理灰棗樹枝干，截留距離地面1 m以上和1 m以下2種高度枝干，用脫脂棉繞截面形成層覆蓋一圈，用滴管將TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L藥液滴于脫脂棉上，以浸濕脫脂棉為宜。然后用塑料袋+ 泥+塑料袋覆蓋截面，每個(gè)處理10個(gè)枝，觀察枝干截面愈傷形成情況。

1.2.3不同覆蓋方式對(duì)形成愈傷的影響

處理灰棗樹枝干，用TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L藥液浸濕形成層上鋪設(shè)的脫脂棉，然后采用“塑料袋+泥+塑料袋”、“泥+塑料袋”和“黑塑料袋”3種覆蓋方式，每種覆蓋方式10個(gè)枝干，觀察枝干截面愈傷形成情況。

1.2.4不同濃度AgNO3對(duì)形成愈傷的影響

處理灰棗樹枝干，用濃度為1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L AgNO3溶液分別滴于脫脂棉上，每個(gè)處理5個(gè)枝，用塑料袋+泥+塑料袋覆蓋截面，觀察枝干截面愈傷形成情況。

1.2.5二甲基亞砜對(duì)形成愈傷的影響

在0.05％秋水仙素+TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L藥液中添加二甲基亞砜，濃度配為2％，把含有2％二甲基亞砜（DMSO）的混合藥液處理灰棗樹枝干截面；另外做不加二甲基亞砜的對(duì)照處理（其他成分同上），塑料袋+泥+塑料袋覆蓋，觀察枝干愈傷形成情況。

1.2.6不同濃度秋水仙素對(duì)形成愈傷及不定芽發(fā)生的影響

處理灰棗樹枝干，把含有秋水仙素（0、0.010％、0.025％、0.050％、0.075％）+TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L的藥液滴加于枝干截面形成層鋪設(shè)的脫脂棉上，處理時(shí)間為1 d（第2天去掉脫脂棉），同時(shí)做1個(gè)完全清水的處理，觀察記錄每個(gè)處理枝干截面愈傷形成及不定芽發(fā)生情況。

2　結(jié)果與分析

2.1不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)形成愈傷的影響

表1　不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷形成的影響

由表1可知，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不同，灰棗枝干愈傷發(fā)生情況也不同。TDZ出愈率最高，達(dá)到了72％。

2.2截干高度對(duì)愈傷形成的影響

表2　截干高度對(duì)愈傷形成的影響

由表2可知，截干高度不同，其截面愈傷發(fā)生情況顯著不同?；覘? m以上枝干截面比低于1 m枝干截面易于發(fā)生愈傷，出愈率差距達(dá)到了50％。同一品種高枝干截面出愈率高于低枝干截面，這可能與頂端優(yōu)勢(shì)有關(guān)。

2.3不同覆蓋方式對(duì)形成愈傷的影響

表3　覆蓋方式對(duì)愈傷形成和出芽的影響

由表3可知，塑料袋+泥+塑料袋覆蓋后枝干截面愈傷出愈率最高，達(dá)100％，而且愈傷發(fā)生快，第5天就有透明愈傷形成，是最優(yōu)化的覆蓋方式；泥+塑料袋覆蓋后枝干截面易霉變，黑塑料袋覆蓋后枝干截面高溫高濕對(duì)愈傷的生長(zhǎng)不利。因此，以塑料袋+泥+塑料袋覆蓋為宜。

2.4不同濃度AgNO3對(duì)形成愈傷的影響

表4　不同濃度AgNO3對(duì)形成愈傷的影響

由表4可知，2.0 mg/L AgNO3的出愈率最高，達(dá)到100％，顯著高于其他3個(gè)濃度。

2.5二甲基亞砜對(duì)形成愈傷的影響

表5　二甲基亞砜對(duì)形成愈傷的影響

由表5可知，添加2％的二甲基亞砜（DMSO）與否對(duì)灰棗枝干截面出愈率影響不明顯。但田間觀察發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致枝干截面愈傷形成時(shí)間推遲，70％的枝干截面到第10天才出現(xiàn)愈傷，愈傷生長(zhǎng)不同步，長(zhǎng)勢(shì)差。而不加二甲基亞砜處理后，90％的枝干截面出愈傷時(shí)間會(huì)提前3 d，愈傷生長(zhǎng)整齊。2％二甲基亞砜與秋水仙素配合使用延遲了愈傷組織的形成，分析二甲基亞砜的使用可能導(dǎo)致了棗樹枝干截面組織細(xì)胞的生理?yè)p傷。因此，在實(shí)踐中應(yīng)適當(dāng)降低二甲基亞砜的使用濃度，在考慮其增加藥劑滲透效果的同時(shí)，還要想到是否對(duì)試驗(yàn)材料有損傷、是否會(huì)影響到試驗(yàn)材料的生長(zhǎng)發(fā)育等因素。

2.6不同濃度秋水仙素對(duì)形成愈傷及不定芽發(fā)生的影響

由表6可知，不同濃度秋水仙素+4.0 mg/L TDZ+2.0 mg/L AgNO3的出愈率沒有受到秋水仙素的抑制影響。如不同濃度秋水仙素處理枝干截面后其出愈率均超過了無秋水仙素的TDZ 4.0 mg/L+ AgNO32.0 mg/L處理，高達(dá)95％。隨著秋水仙素濃度的增加，出愈率并沒有降低。分析可能是由于秋水仙素濃度偏低的原因，也表現(xiàn)出了田間棗樹枝干截面愈傷組織對(duì)秋水仙素有一定的忍耐能力。

從秋水仙素處理后的出芽率來看，灰棗在0.025％秋水仙素時(shí)出現(xiàn)最小值，與最大值50％差異水平顯著。TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L處理與水處理比較，出芽率無顯著差異。在添加秋水仙素后，不定芽的發(fā)生受到抑制，表現(xiàn)為隨著秋水仙素濃度的增加（0.010％～0.075％），出現(xiàn)高-低-高-低的變化趨勢(shì)，秋水仙素濃度為0.05％時(shí)，出芽率最高。

3　小結(jié)

通過對(duì)愈傷組織發(fā)生影響因子的分析，獲得變異芽的最佳方法為：對(duì)灰棗樹枝干進(jìn)行短截后，先滴加TDZ 4.0 mg/L+AgNO32.0 mg/L于形成層的脫脂棉上，塑料袋+泥+塑料袋覆蓋處理。誘導(dǎo)愈傷組織5～6 d后，枝干截面泛紅褐色，形成層開裂，有透明微弱愈傷出現(xiàn)時(shí)，去除塑料袋、泥、脫脂棉等覆蓋物，露出愈傷組織，用脫脂棉覆蓋愈傷組織，把6～10滴濃度為0.05％的秋水仙素 （含有1％二甲基亞砜）滴加到脫脂棉上。迅速覆上塑料袋，將和好的濕泥覆蓋在塑料袋上，最外面再用塑料袋全部套住，用塑料繩收緊袋口。24 h后，去除脫脂棉，用濕泥直接覆蓋愈傷組織再用塑料袋套住，用塑料繩收緊袋口。5～7 d后，檢查愈傷組織的生長(zhǎng)情況，正常的愈傷組織生長(zhǎng)量增加，多呈黃白色。對(duì)生長(zhǎng)欠佳的愈傷組織（愈傷組織呈紅褐色，生長(zhǎng)量?。?，可用TDZ 4.0 mg/L、AgNO3 2.0 mg/L藥液進(jìn)行二次誘導(dǎo)處理，再次用塑料袋+濕泥+塑料袋覆蓋。15～20 d后會(huì)有大量芽點(diǎn)出現(xiàn)，當(dāng)芽長(zhǎng)到1～2 cm時(shí)，去除所有覆蓋物。

［1］H，杜比寧.植物育種的遺傳學(xué)原理［M］.北京：科學(xué)出版社，1974.

［2］劉璐璐，柴明良.秋水仙素在果樹多倍體育種中的研究進(jìn)展［J］.北方園藝，2006（6）：48-49.

［3］石蔭坪.棗胚乳三倍體的育成及生物學(xué)細(xì)胞學(xué)研究［J］.山東果樹，1985（1）：1-3.

［4］王娜，劉孟軍，代麗，等.秋水仙素離體誘導(dǎo)冬棗和酸棗四倍體［J］.園藝學(xué)報(bào)，2005，32（6）：1008-1012.

［5］蔣洪恩，劉孟軍.秋水仙堿誘導(dǎo)棗多倍體的研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2004，31（5）：647-650.

［6］寧強(qiáng).棗愈傷組織誘導(dǎo)及多倍體誘變研究［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

2016—06—21