鄧浩輝，許敏，高洪波，關(guān)玉娟

廣州地區(qū)424例乙型肝炎患者病毒基因亞型分布與乙型肝炎疾病譜的關(guān)系探討*

鄧浩輝，許敏，高洪波，關(guān)玉娟

目的調(diào)查廣州地區(qū)乙型肝炎病毒（HBV）基因亞型分布情況，并探討其與HBV感染疾病譜的關(guān)系。方法采用直接測(cè)序法測(cè)定S基因序列并構(gòu)建基于S基因進(jìn)化樹，對(duì)424例HBV感染者進(jìn)行研究，隨機(jī)選擇慢性乙型肝炎（CHB）137例，HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭（HB-ACLF）90例，肝硬化（LC）90例和肝細(xì)胞癌（HCC）107例，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行x2檢驗(yàn)、方差分析和多元Logistic回歸分析。結(jié)果在424例HBV感染者中，B2亞型269例（63.44%），C1亞型117例（27.59%），C2亞型36例（8.49%），C5亞型2例（0.47%），未發(fā)現(xiàn)其他亞型；CHB患者感染HBV B2亞型、C1亞型、C2亞型和C5亞型分別為70.1%、24.09%、5.11%和0.73%；HB-ACLF患者感染HBV B2亞型、C1亞型和C2亞型分別為87.78%、7.78%、4.44%，其中HBV B2基因亞型顯著高于CHB（x2=9.641，P=0.002）、LC（x2=19.565，P=0.000）、HCC患者（x2=26.789，P=0.000）；LC患者感染HBV B2亞型、C1亞型和C2亞型分別為50.00%、36.67%、13.33%，其中HBV C1和C2亞型顯著高于CHB患者（x2=6.262，P=0.012；x2=4.790，P=0.029）或HB-ACLF患者（x2=25.894，P=0.000；x2=4.390，P=0.036）；HCC患者感染HBV B2亞型、C1亞型、C2亞型和C5亞型分別為45.79%、41.12%、12.15%、0.93%，其中HBV C1和C2亞型也顯著高于CHB患者（x2=11.264，P=0.001；x2=3.957，P=0.047）或HB-ACLF患者（x2=28.327，P=0.000；x2=3.904，P=0.048）；LC和HCC患者HBV C1和C2基因亞型無明顯差異（x2=0.429，P=0.512；x2=0.804，P=0.833）；多因素Logistic回歸分析提示B2亞型是HB-ACLF發(fā)生的危險(xiǎn)因素（OR=2.597，95%CI=1.145～5.891，P=0.022），C型是HCC發(fā)生的危險(xiǎn)因素（OR=3.257，95%CI=1.49～7.194，P=0.003）。結(jié)論廣州地區(qū)HBV基因亞型主要由B2、C1和C2亞型構(gòu)成，同時(shí)也存在C5亞型；廣州地區(qū)B2亞型感染者可能更易發(fā)生HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭，而C1和C2亞型感染者可能更易進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。

乙型肝炎；HBV基因亞型；直接測(cè)序法；進(jìn)化樹

本研究采用S基因直接測(cè)序并構(gòu)建基于S基因進(jìn)化樹法對(duì)HBV進(jìn)行分型，對(duì)廣州地區(qū)424例HBV感染者進(jìn)行基因亞型測(cè)定，以探討HBV基因亞型與HBV感染不同疾病譜的關(guān)系。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象2011年3月～2015年8月于我院門診或住院的HBV感染者424例，其中CHB 137例，HB-ACLF 90例，LC 90例，HCC 107例。CHB和LC的診斷符合2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］，HB-ACLF的診斷符合2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)肝衰竭與人工肝學(xué)組和中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)重型肝病與人工肝學(xué)組發(fā)布的《肝衰竭診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，HCC的診斷符合2011年中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。

1.2血清HBV DNA檢測(cè)及基因分型使用德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAamp DNA mini kit提取血清DNA，取血清DNA 200μL，保存于-20℃冰箱備檢。使用Primer Premier 6.0軟件，根據(jù)HBV保守序列設(shè)計(jì)引物（引物由廣州英韋創(chuàng)津公司合成），行半巢式PCR反應(yīng)，擴(kuò)增S基因。引物序列如下：P1（5' -CCTCCTCCTGCCTCCACCAAT-3'3121-3141），P2（5'-GCAGTATGGATCGGCAGAGGAG-3'1274-12 53），P3（5'-CCCAACTTCCAATTACATATCCCAT-3'901-877）。使用QIAGEN DNA純化試劑盒純化后送廣州英韋創(chuàng)津公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為P4（5' -ATGAATTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCC-3' 48-75），測(cè)序儀器為ABI 3730 DNA測(cè)序儀，使用Bioedit軟件查看序列峰圖。在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找已經(jīng)確定的HBV亞型序列，使用Mega 5.0軟件Neighbor-joining法構(gòu)建基于S基因的基因進(jìn)化樹進(jìn)行分型。

2　結(jié)果

2.1年齡和性別比較424例HBV感染者年齡和性別比較見表1，CHB患者男性顯著少于HB-ACLF患者（x2=9.512，P=0.002）或HCC患者（x2=11.858，P=0.001）；CHB患者年齡顯著小于HB-ACLF患者（t=-2.243，P=0.029）、LC患者（t=-2.790，P=0.07）或HCC患者（t=-2.516，P=0.015），HB-ACLF患者年齡顯著小于LC患者（t=-2.612，P=0.012）。

表1　各組HBV感染者年齡和性別（n?±s）比較

表1　各組HBV感染者年齡和性別（n?±s）比較

與CHB組比，①P＜0.05；與HB-ACLF組比，②P＜0.05

例數(shù)性別（男/女）年齡（歲）CHB137104/3332.3±10.5 HB-ACLF9083/7①38.5±12.1①LC9076/1449.6±11.2①②HCC10799/8①43.5±11.4①

2.2HBV基因分型情況對(duì)第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見目的片度，大小約為1000 bp，與設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段大小相符（圖1）。對(duì)PCR陽性產(chǎn)物測(cè)序后經(jīng)進(jìn)化樹分析確定其基因亞型。在424例HBV感染者中，發(fā)現(xiàn)B2亞型269例（63.44%），C1亞型117例（27.59%），C2亞型36例（8.49%），C5亞型2例（0.47%），未發(fā)現(xiàn)其他亞型。

圖1　HBV S基因產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

2.3各組HBV感染者HBV基因亞型比較HB-ACLF患者HBV B2基因型顯著高于CHB（x2=9.641，P=0.002）、LC（x2=19.565，P=0.000）、HCC患者（x2= 26.789，P=0.000）；LC患者HBV C1和C2亞型顯著高于CHB（x2=6.262，P=0.012；x2=4.790，P=0.029）和HB-ACLF患者（x2=25.894，P=0.000；x2=4.390，P=0.036）；HCC患者HBV C1和C2亞型也顯著高于CHB（x2=11.264，P=0.001；x2=3.957，x2=0.047）和HBACLF患者（x2=28.327，P=0.000；x2=3.904，P=0.048）；LC和HCC患者HBV C1和C2基因型無明顯差異（x2=0.429，P=0.512；x2=0.804，P=0.833，表2）。

2.4HBV基因型與病情的關(guān)系分析因C2亞型感染患者例數(shù)較少，故將C1和C2亞型合并為C型進(jìn)行分析，以性別、年齡、HBeAg、HBV基因型為變量，將CHB患者作為對(duì)照組，使用多因素Logistic回歸進(jìn)行分析，結(jié)果提示B2亞型是HB-ACLF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.022），C型為HCC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P=0.003，表3、表4）。

表2　各組HBV感染者HBV基因亞型分布（%）比較

表3　HBV感染者發(fā)生HB-ACLF影響因素的多因素logistic回歸分析

表4　HBV感染者發(fā)生HCC影響因素的多因素logistic回歸分析

3　討論

HBV基因型與HBV感染疾病譜、臨床轉(zhuǎn)歸和抗病毒治療療效有關(guān)［4～6］。目前，根據(jù)HBV核苷酸全序列或S基因序列的異質(zhì)性可以將HBV分為10個(gè)基因型［7～9］。HBV基因型又可以分為許多亞型，如B型和C型分別可被分為10多個(gè)亞型［10-17］，不同地域流行的基因型并不一致。國(guó)內(nèi)有學(xué)者曾研究我國(guó)HBV基因型分布，發(fā)現(xiàn)我國(guó)以B型和C型為主，占我國(guó)HBV基因型的95%以上，其中B基因型均為B2亞型，C型為C1和C2兩種亞型，A型和D型較少。在我國(guó)西部地區(qū)還發(fā)現(xiàn)C/D基因型重組體［18］。

既往研究表明C5亞型主要流行于菲律賓等地區(qū)［15］。在本研究發(fā)現(xiàn)的2例患者中，1例為慢性乙型肝炎患者，來自廣州佛山，1例為肝癌患者，來自番禺。兩名患者均在廣州出生、長(zhǎng)大，未曾到國(guó)外居住或旅游，無輸血和吸毒史。

既往研究表明HBV基因型與HBV感染疾病譜有關(guān)，如日本地區(qū)的B1型、美國(guó)地區(qū)的D型在暴發(fā)性肝炎的流行率較高［19～21］，C型較B型易發(fā)生肝硬化和肝癌［22，23］。本研究發(fā)現(xiàn)HB-ACLF患者B2亞型比例明顯多于其他亞型，但隨著乙型肝炎慢性化的進(jìn)展，C1和C2亞型患者比例逐漸升高，表明B2亞型易發(fā)生HB-ACLF，C1、C2亞型與乙型肝炎慢性化感染有關(guān)，易進(jìn)展至肝硬化和肝癌。B2亞型較C1和C2亞型更容易使病毒活躍復(fù)制，從而促進(jìn)HB-ACLF的發(fā)生；相反，C1和C2亞型更容易導(dǎo)致宿主對(duì)HBV免疫逃逸，從而導(dǎo)致HBV感染的慢性化。C1和C2亞型在LC和HCC患者分布無明顯差異，與既往研究基本一致［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)2例C5亞型感染者，下一步研究將對(duì)他們感染亞型進(jìn)行HBV全基因序列測(cè)序，了解本地區(qū)流行的C5亞型的序列特點(diǎn)。另外，本研究為橫斷面研究，有必要對(duì)患者追蹤觀察，進(jìn)一步探討不同HBV基因亞型感染與HBV疾病譜的關(guān)系。

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（收稿：2016-04-15）

（本文編輯：陳從新）

Hepatitis B virus subgenotypes in 424 patients with hepatitis B，hepaticfailure，liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma in Guangzhou

Deng Haohui，Xu Min，Gao Hongbo，etal.
Department ofLiver Disease，Eighth People's Hospital，Guangzhou 510060，Guangdong Province，China Corresponding author:Guan Yujuan，E-mail:gz8hgyj@126.com

ObjectiveTo investigate hepatitis B virus（HBV）subgenotypes distribution and its implication in patients with chronic hepatitis B in Guangzhou.Methods424 patients were enrolled in this study，including 137 with chronic hepatitis B（CHB），90 with HBV-related acute-on-chronic liver failure（HB-ACLF），90 with 1iver cirrhosis（LC）and 107 with hepatocellular carcinoma（HCC）.HBV subgenotypes were determined by direct sequencing of HBV S gene and the phylogenetic tree was constructed.The data was compared by x2test，one way ANOVA and Logistic regression analysis.ResultsOut of 424 patients with HBV infection，269（63.44%）were infected with HBV B2，117（27.59%with HBV C1，36（8.49%）with HBV C2 and 2（0.47%）with C5;the HBV B2，C1，C2 and C5 Infection in patients with CHB were 70.1%，24.09%，5.11%，0.73%；the HBV B2，C1 and C2 in patients with HB-ACLF were 87.78%，7.78%，4.44%，with HBV B2 subgenotpe significantly higher than in patients with CHB（x2=9.641，P=0.002），with LC（x2=19.565，P= 0.000）orwithHCC（x2=26.789，P=0.000）；the subgenotypes of HBV B2，C1 and C2 in patients with LC were 50.00%，36.67%，13.33%，with HBV C1 and C2 subgenotpes significantly higher than in patients with CHB（x2=6.262，P=0.012，x2=4.790，P=0.029）or in patients with HB-ACLF（x2=25.894 P=0.000，x2=4.390，P=0.036）；the subgenotypes of HBV B2，C1，C2 and C5 in HCC patients were 45.79%，41.12%，12.15%，0.93，with HBV C1 and C2 subgenotypes significantly higher than in patients with CHB（x2=11.264，P=0.001，x2=3.957，P= 0.047）or in patients with HB-ACLF（x2=28.327，P=0.000，x2=3.904，P=0.048）；there was no significant difference between HCC patients with HBV C1 and C2 subgenotype infection and LC patients；Logistic regression analysis showed that HBV B2 subgenotype was the independent risk factor for HB-ACLF occurrence，and HBV C genotype wasthe independent risk factor for HCC occurrence.ConclusionHBV B2，C1，C2 are the most frequent HBV subgenotypes in Guangzhou.The HBV B2 subgenotpe is prevalent in patients with HB-ACLF and HBV C1 and C2 is frequent in patients with LC and HCC.

Hepatitis B；HBV Subgenotypes；Sequence analysis；Phylogenetic tree

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.05.005

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2014Y2-00079）

510060廣州市第八人民醫(yī)院重癥肝病科（鄧浩輝，許敏，高洪波）；肝病二科（關(guān)玉娟）

鄧浩輝，男，31歲，碩士研究生，主治醫(yī)師。主要從事病毒性肝炎防治研究。E-mail：gz8hdhh@126.com

關(guān)玉娟，E-mail：gz8hgyj@126.com