馬寧　鮑順淑　連青龍

摘要：AP3基因?qū)儆贛ADS-box基因家族中控制花器官發(fā)育的B類基因，與PI基因一起參與控制植物花瓣和雄蕊的形成?？寺〉搅死苯房刂苹ㄆ鞴侔l(fā)育的PAP3基因（GenBank登錄號：HM104635），該基因全長929 bp，編碼226個氨基酸，具有典型的MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域；與其他6種植物同源基因比對顯示，它們的氨基酸序列相似性在82%～91%之間；系統(tǒng)進化樹分析表明，PAP3屬于MADS-box基因家族中的AP3/PI亞族成員，與辣椒花器官發(fā)育相關(guān)。

關(guān)鍵詞：辣椒；PAP3基因；花器官發(fā)育；生物信息學(xué)

中圖分類號： S641.303.2 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0052-03

AP3基因均屬于MADS-box基因家族中控制花器官發(fā)育的B類基因。參與調(diào)控高等植物花器官發(fā)育的 MADS-box基因是近年來植物發(fā)育生物學(xué)研究的熱點，目前已經(jīng)在多種作物上克隆到B類基因[1-2]。經(jīng)研究表明，B類基因參與花瓣、雄蕊的形成。在喪失功能的突變體中，萼片代替第2輪花瓣，第3輪雄蕊轉(zhuǎn)變?yōu)樾钠3-4]，植物B類基因結(jié)構(gòu)屬于植物MADS-box基因家族，含有相同的4個區(qū)域：MADS結(jié)構(gòu)域、K結(jié)構(gòu)域、I結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域。啟動子表達特性的分析顯示，AP3基因啟動子為花器官特異表達啟動子[5]。最新研究表明，AP3基因的表達形式取決于編碼轉(zhuǎn)錄因子的分生組織特征基因LEAFY、AP1，并且配合著不尋常的花器官活動，編碼了F-BOX蛋白[6-8]。AP3在擬南芥花瓣、雄蕊的整個發(fā)育過程中均有表達，但是在非花組織中不表達[9-11]。

本研究從實驗室已經(jīng)構(gòu)建的辣椒不育系和恢復(fù)系的差減cDNA文庫中獲得辣椒恢復(fù)基因誘導(dǎo)的EST片段TA288[12]，利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技術(shù)進行全長cDNA克隆，獲得了辣椒花器官發(fā)育PAP3基因的全長，并利用 RT-PCR 技術(shù)、Northern blot技術(shù)檢測了該基因在辣椒不同材料、不同器官上及小孢子發(fā)育的不同時期的表達量差異，以期為闡明辣椒花器官發(fā)育的分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以辣椒細胞質(zhì)雄性不育系121A及其相應(yīng)的恢復(fù)系121C為試驗材料（筆者所在實驗室育種材料）。2012年春季在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊實驗站大棚內(nèi)常規(guī)種植。在開花期，取121C花瓣已開始變白的花蕾，剝?nèi)』ㄋ幒罅⒓从靡旱鋬霾⒃?70 ℃保存?zhèn)溆?，用于基因全長克隆。

1.2 總RNA的提取及基因的全長克隆

總RNA的提取依照SV Total RNA Isolation System kit（美國 Promega 公司）操作說明書進行。基因全長克隆采用 RACE 技術(shù)，按照 Smart Race cDNA Amplification Kit（美國 Clontech 公司）試劑盒說明書進行。根據(jù)實驗室已經(jīng)獲得的 EST 片段分別設(shè)計 3′端、5′端特異引物（5′-TGAGTGTGCGAATGATTGCTGGGGGTTT-3′）、（5′-ACCCCCAGCAATCATTCGCACACTCAAA-3′）進行cDNA末端快速擴增（RACE）。擴增產(chǎn)物采用北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司的DNA凝膠回收試劑盒回收。插入pGEM-T Easy載體（美國Promega公司），熱激法轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞（中國天根公司）中，在氨芐青霉素平板上進行陽性克隆篩選，送交三博遠志生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上 進行Blast比對，用 DNAMAN軟件進行序列分析，用MEGA 41軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒PAP3基因的克隆與序列分析

在已經(jīng)構(gòu)建的辣椒CMS誘導(dǎo)表達的cDNA文庫中，篩選到 EST序列TA288，經(jīng)Blast比對分析表明，該片段與植物花器官發(fā)育AP3基因序列有較高的同源性，推測其為辣椒花器官發(fā)育MADS-box基因之一，進而設(shè)計特異引物序列進行3′、5′RACE擴增，分別獲得752 bp的3′端序列、625 bp的5′端序列。利用DNAMAN軟件去除2端載體序列和重疊部分，將2段序列進行拼接，得到長度為929 bp的基因全長序列，命名為PAP3（GenBank登錄號：HM104635）。用特異性引物在基因組DNA和cDNA上同時擴增PAP3基因，瓊脂糖跑膠結(jié)果顯示條帶完全相同，測序后分析序列完全相同（圖1）。

PAP3基因包含678 bp的開放閱讀框，編碼1個含226個氨基酸的蛋白質(zhì)，推測的分子量為75.9 ku，推測的等電點為4.97。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，PAP3蛋白含有典型的MADS結(jié)構(gòu)域（氨基酸序列第2～61位）和K結(jié)構(gòu)域（氨基酸序列第86-176）2個保守結(jié)構(gòu)域（圖2、圖3）。由此推測：PAP3基因應(yīng)屬于MADS-box基因家族Ⅱ型基因。

2.2 PAP3氨基酸序列同源性比較與系統(tǒng)進化樹分析

由圖4可以看出，氨基酸序列的5′端保守性較高，而3′端保守性較低，這是MADS-box基因的典型特征。這6個序列是從NCBI上下載，并用DNAMAN軟件進行分析的，分別為番茄（NM_001247148）、矮牽牛（Q07472）、馬鈴薯（X67508）、曼陀羅（AEM60197）、風(fēng)茄（DQ539405）、煙草（X96428）序列。

在擬南芥中與花發(fā)育相關(guān)的MADS-box基因分為5個亞族：AP1、AP3/PI、AG、AGL2和孤兒亞族。以擬南芥中的5個亞族作為對照，選取其中一些典型基因?qū)AP3基因進行系統(tǒng)進化樹分析，圖5結(jié)果表明，PAP3基因與擬南芥AP3

（NP_191002）基因聚為一類，屬于MADS-box基因家族中的AP3/PI亞族成員，為植物花器官發(fā)育B類功能基因。3 討論

與其他作物相比，在辣椒中大多數(shù)的MADS-box基因仍未被克隆及研究，本試驗通過RACE技術(shù)克隆了辣椒花器官發(fā)育相關(guān)的1個MADS-box基因PAP3。氨基酸序列分析和蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，PAP3基因含有典型的MADS-box區(qū)域、K-box區(qū)域，N端的保守性高于C端。并且與番茄的TAP3 （NM_001247148）、擬南芥（NP191002）具有很高的序列同源性，因此屬于MADS-box基因家族。

系統(tǒng)樹分析表明，PAP3基因?qū)儆贛ADS-box基因家族中的AP3/PI亞家族成員，為ABC花發(fā)育模型理論中的B功能基因，控制植物花瓣和雄蕊的發(fā)育[13-17]。與AP1亞家族相比，對AP3/PI亞家族的研究比較深入。在這個亞家族的進化過程中主要發(fā)生了2次基因重復(fù)事件。1次基因重復(fù)事件發(fā)生在現(xiàn)存的被子植物產(chǎn)生之前，產(chǎn)生了AP3/DEF、PI/GLO 這2個進化系；隨后，AP3/DEF進化系中又發(fā)生了1次基因重復(fù)事件，發(fā)生在核心真雙子葉植物基部，相似于 euAP1 重復(fù)的位置，結(jié)果產(chǎn)生TM6、euAP3進化系。在這個亞家族里，經(jīng)歷基因重復(fù)后，在擬南芥中產(chǎn)生了AP3、PI基因，金魚草中產(chǎn)生了DEF、GLO基因[18-20]。

本研究表明，PAP3基因?qū)儆贛ADS-box基因家族中控制花瓣和雄蕊發(fā)育的B功能基因，今后可通過繼續(xù)深入研究PAP3基因的功能，最終為闡明辣椒花器官發(fā)育的分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Tsai W C，Lee P F，Chen H I，et al. PeMADS6，a GLOBOSA/PISTILLATA-like gene in Phalaenopsis equestris involved in petaloid formation，and correlated with flower longevity and ovary development[J]. Plant & Cell Physiology，2005，46（7）：1125-1139.

[2]Vandenbussche M，Zethof J，Royaert S，et al. The duplicated B-class heterodimer model：whorl-specific effects and complex genetic interactions in Petunia hybrida flower development[J]. The Plant Cell，2004，16（3）：741-754.

[3]Preston J C，Hileman L C. SQUAMOSA-PROMOTER BINDING PROTEIN 1 initiates flowering in Antirrhinum majus through the activation of meristem identity genes[J]. The Plant Journal，2010，62（4）：704-712.

[4]Shindo C，Lister C，Crevillen P，et al. Variation in the epigenetic silencing of FLC contributes to natural variation in Arabidopsis vernalization response[J]. Genes & Development，2006，20（22）：3079-3083.

[5]Verdonk J C，Shibuya K，Loucas H M，et al. Flower-specific expression of the Agrobacterium tumefaciens isopentenyltransferase gene results in radial expansion of floral organs in Petunia hybrida[J]. Plant Biotechnology Journal，2008，6（7）：694-701.

[6]Chae E，Tan Q K，Hill T A，et al. An arabidopsis f-box protein acts as a transcriptional co-factor to regulate floral development[J]. Development，2008，135（7）：1235-1245.

[7]Liu Y，Schiff M，Dinesh-Kumar S P. Virus-induced gene silencing in tomato[J]. Plant Journal，2002，31（6）：777-786.

[8]Xu G，Ma H，Nei M，et al. Evolution of F-box genes in plants：different modes of sequence divergence and their relationships with functional diversification[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（3）：835-840.

[9]Elitzur T，Vrebalov J，Giovannoni J J，et al. The regulation of MADS-box gene expression during ripening of banana and their regulatory interaction with ethylene[J]. Journal of Experimental Botany，2010，61（5）：1523-1535.

[10]Colombo M，Masiero S，Vanzulli S，et al. AGL23，a type I MADS-box gene that controls female gametophyte and embryo development in Arabidopsis[J]. The Plant Journal，2008，54（6）：1037-1048.

[11]Tsaftaris A，Pasentsis K，Makris A，et al. The study of the E-class SEPALLATA3-like MADS-box genes in wild-type and mutant flowers of cultivated saffron crocus （Crocus sativus L.） and its putative progenitors[J]. Journal of Plant Physiology，2011，168（14）：1675-1684.

[12]郭 爽，沈火林，楊文才，等. 利用抑制消減雜交技術(shù)分離辣椒細胞質(zhì)雄性不育育性恢復(fù)相關(guān)EST[J]. 園藝學(xué)報，2009，36（10）：1443-1449.

[13]Becker A，Theissen G. The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2003，29（3）：464-489.

[14]Kim S H，Mizuno K，F(xiàn)ujimura T. Isolation of MADS-box genes from sweet potato （Ipomoea batatas （L.） Lam.） expressed specifically in vegetative tissues[J]. Plant & Cell Physiology，2002，43（3）：314-322.

[15]Li H L，Wang Y，Guo D，et al. Three MADS-box genes of Hevea brasiliensis expressed during somatic embryogenesis and in the laticifer cells[J]. Molecular Biology Reports，2011，38（6）：4045-4052.

[16]Mathew R，Rosenthal A，F(xiàn)ellows K，et al. MADS-box gene family in rice：genome-wide identification，organization and expression profiling during reproductive development and stress[J]. BMC Genomics，2007，8：242.

[17]Zhang B，Su X，Zhou X. A MADS-box gene of Populus deltoides expressed during flower development and in vegetative organs[J]. Tree Physiology，2008，28（6）：929-934.

[18]Whipple C J，Ciceri P，Padilla C M，et al. Conservation of B-class floral homeotic gene function between maize and Arabidopsis[J]. Development，2004，131（24）：6083-6091.

[19]Aoki S，Uehara K，Imafuku M，et al. Phylogeny and divergence of basal angiosperms inferred from APETALA3-and PISTILLATA-like MADS-box genes[J]. Journal of Plant Research，2004，117（3）：229-244.

[20]劉菊華，徐碧玉，張 靜，等. MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的相互作用及對果實發(fā)育和成熟的調(diào)控[J]. 遺傳，2010，32（9）：893-902.