金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

張棋　胡永紅　楊文革

摘要：為了優(yōu)化金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法建立發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化模型。得到最優(yōu)的培養(yǎng)基為：蔗糖20.07 g/L、酵母膏20.04 g/L、MgSO4 0.70 g/L。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下，金龜子綠僵菌的生物量可達(dá)16.523 g/L，比優(yōu)化前提高了37.24%。

關(guān)鍵詞：金龜子綠僵菌；培養(yǎng)基；響應(yīng)面法；優(yōu)化條件

中圖分類(lèi)號(hào)： S188+.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）07-0173-04

金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）是一類(lèi)重要的昆蟲(chóng)病原真菌，它作為生物防治制劑具有環(huán)境安全性好、昆蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)。此外，綠僵菌的寄主廣泛性和廣譜性使得其成為一種研究昆蟲(chóng)病原真菌侵染寄主過(guò)程的重要模式生物[1-2]。目前，植物病害在全球范圍內(nèi)每年造成高達(dá)數(shù)千億美元的損失，而其中又以昆蟲(chóng)病害最為嚴(yán)重。金龜子綠僵菌具有寄生范圍廣、無(wú)殘毒、后效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，已成為國(guó)內(nèi)外殺菌、除蟲(chóng)的一線藥物之一[3-4]。然而，在金龜子綠僵菌發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，菌體生物量低，生產(chǎn)成本高，發(fā)酵周期長(zhǎng)等問(wèn)題限制了其推廣應(yīng)用[5-7]；因此，對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及條件探索具有重大意義。本研究以金龜子綠僵菌NJYHWG 3820為試驗(yàn)菌株，應(yīng)用響應(yīng)面法系統(tǒng)考察了影響金龜子綠僵菌生物量的培養(yǎng)基成分，得到了最佳培養(yǎng)基配方，從而提高了生物量。

1 材料與方法

1.1 菌種

金龜子綠僵菌：Metarhizium anisopliae NJYHWG 3820，由筆者課題組保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，蔗糖20 g/L，瓊脂15～20 g/L，自然pH值。

種子培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 2 g/L，pH值6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 2 g/L，pH值6.5。

1.3 主要試劑和儀器

蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘油、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏、甘氨酸、瓊脂粉，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、NaCl、K2HPO4·3H2O、CaCl2、NaNO3、CuSO4、CaCO3，由廣東汕頭市西隴化工廠提供；馬鈴薯，市售。

電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；滅菌鍋，華粵行儀器有限公司；醫(yī)用凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱，上海試驗(yàn)儀器廠有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；基礎(chǔ)分析型純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 金龜子綠僵菌生物量測(cè)定 取發(fā)酵液倒入50 mL的離心管中，10 000 r/min離心15 min，去上清。沉淀的菌體用去離子水懸浮，再離心2次，去上清。把菌體倒在干凈的已稱(chēng)質(zhì)量的稱(chēng)量紙上，放入80 ℃的烘箱烘干至恒質(zhì)量，在電子天平上稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算干菌體質(zhì)量：菌體生物量（g/L）=菌體干質(zhì)量（g）/發(fā)酵液取樣體積（L）。

1.4.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別對(duì)碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行優(yōu)化，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)5 d，測(cè)定每種因素對(duì)生物量的影響，選擇最佳培養(yǎng)基成分。

1.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.3.1 Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)試驗(yàn) 利用Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)從多個(gè)單因素中篩選出對(duì)菌體生長(zhǎng)影響最顯著的幾個(gè)因素，使用Design Expert 6.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，包括11個(gè)變量（n=11），其中8個(gè)主要變量（蔗糖、乳糖、甘油、蛋白胨、酵母膏、MgSO4、KH2PO4、CaCl2）和3個(gè)虛擬變量，分別用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K來(lái)代表變量，每個(gè)變量有高（+）和低（-）2個(gè)水平，設(shè)置高（+）水平是低（-）水平的1.5倍（表1）。

1.4.3.2 最陡爬坡試驗(yàn) 在PB試驗(yàn)中得到影響較為顯著的3個(gè)因素，并且根據(jù)PB設(shè)計(jì)得出的一次項(xiàng)擬合方程中相應(yīng)變量的系數(shù)，從而確定變化梯度和爬坡方向。若變量系數(shù)為負(fù)，則該變量水平以梯度遞減的方向進(jìn)行爬坡試驗(yàn)。若變量系數(shù)為正，則該變量水平以梯度遞增的方向進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，這樣就能夠經(jīng)濟(jì)、快速地逼近最佳區(qū)域。將最陡爬坡試驗(yàn)中得到的金龜子綠僵菌生物量最高點(diǎn)作為中心組合設(shè)計(jì)的的中心點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案。

1.4.3.3 響應(yīng)面分析法 經(jīng)過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)，逼近金龜子綠僵菌發(fā)酵生物量最大化區(qū)域，根據(jù) Box-Bellnken 原理，對(duì)經(jīng)過(guò)PB和爬坡試驗(yàn)的變量進(jìn)行3水平試驗(yàn)（-1、0、+1），共17組試驗(yàn)，使用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，研究金龜子綠僵菌的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵的影響 碳源是菌體碳架構(gòu)成及能量供應(yīng)的來(lái)源。由圖1可知，在選擇的7種碳源中蔗糖、甘油和乳糖對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵效果較為理想，其中蔗糖效果最好。其他幾種碳源對(duì)生物量的影響較小，該金龜子綠僵菌對(duì)其他4種碳源利用率不高。

2.1.2 氮源對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵的影響 氮源是構(gòu)成菌體蛋白、核酸等含氮物質(zhì)的來(lái)源。由圖2可知，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵的影響更為顯著，在有機(jī)氮源培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)良好；而在無(wú)機(jī)氮源培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)較稀疏。在有機(jī)氮源中，酵母膏效果最好，蛋白胨次之。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵的影響 無(wú)機(jī)鹽是微生物生命活動(dòng)所不可缺少的物質(zhì)，它的種類(lèi)和含量對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的生成影響很大。由圖3可知，MgSO4對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵影響最大，KH2PO4和CaCl2次之；因此在下個(gè)階段的PB設(shè)計(jì)中，將MgSO4、KH2PO4、CaCl2作為考察因素。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn) 通過(guò)單因素試驗(yàn)表明，對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較大的8個(gè)主要變量為蔗糖、乳糖、甘油、酵母膏、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4和CaCl2，再加3個(gè)虛擬變量，每個(gè)變量有高（+）、低（-）2個(gè)水平，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，共計(jì)12組試驗(yàn)（表2）。使用Design-Expert軟件對(duì)表2進(jìn)行分析，得到表3。由表3可知，上述8個(gè)因素對(duì)金龜子綠僵菌生物量的影響順序由大到小為：蔗糖、酵母膏、MgSO4、乳糖、蛋白胨、甘油、CaCl2、KH2PO4，其中蔗糖為極顯著因素。該模型R2=0.988 4，表示98.84%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以使用該模型進(jìn)行解釋。Prob>F值小于0.05表示該因素為顯著因素，從8個(gè)因素中選出對(duì)金龜子綠僵菌生長(zhǎng)顯著的因素（蔗糖、酵母膏、MgSO4），進(jìn)行下一步試驗(yàn)優(yōu)化。

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，蔗糖、酵母膏、MgSO4的模型方程系數(shù)為正值，進(jìn)行正爬坡。具體設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，選擇第5組試驗(yàn)方案時(shí)，即蔗糖20 g/L、酵母膏20 g/L、MgSO4 0.7 g/L，對(duì)應(yīng)的生物量達(dá)到最高值，以此值為中心值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，這樣響應(yīng)面方程才能充分逼近真實(shí)值。

2.2.3 響應(yīng)面分析法 經(jīng)過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)和爬坡試驗(yàn)，確定蔗糖、酵母膏、MgSO4的水平，利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)見(jiàn)表5、表6。根據(jù)表6的數(shù)據(jù)，使用 Design-Expert 軟件進(jìn)行擬合，得到三元二次回歸方程：Y =-303.58+6.90A+6.79B+523.41C+0.03AB-1.16AC-141BC-0.16A2-0.16B2-338.12C2，其中：Y為菌體生物量，A、B、C分別為蔗糖、酵母膏、MgSO4濃度。根據(jù)表6的結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)其進(jìn)行方差分析和模型的顯著性分析，得到表7。由表7可知：該模型的P

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的分析

由二元回歸方程所得到的響應(yīng)面圖與相應(yīng)的等高線圖見(jiàn)圖4至圖6。各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值菌體生物量的影響由圖可以直觀地反映出來(lái)[8-10]。圖4表明，在MgSO4一定的情況下，蔗糖和酵母膏的交互作用顯著，隨著蔗糖和酵母膏含量的增加，菌體生物量不斷提高，后期呈現(xiàn)小幅下降。

由圖5可知，在酵母膏一定的情況下，隨著蔗糖和MgSO4含量的增加，菌體生物量不斷提高，后期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在一定程度上，提高培養(yǎng)基中蔗糖和MgSO4的含量有利于提高菌體生物量，但蔗糖濃度過(guò)高會(huì)影響細(xì)胞通透性，抑制菌體生長(zhǎng)，不利于生物量的增加。

由圖6可知，在蔗糖一定的情況下，酵母膏和MgSO4交互作用較顯著，隨著酵母膏和MgSO4含量的增加，菌體生物量不斷提高，后期呈現(xiàn)小幅下降。

為求出培養(yǎng)基最佳配方，對(duì)回歸方程各個(gè)變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，解得：A=20.07，B=20.04，C=0.70，此時(shí)金龜子綠僵菌生物量達(dá)到16.173 g/L。同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，在最適發(fā)酵條件下，重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，金龜子綠僵菌生物量實(shí)測(cè)值為16.523 g/L，與預(yù)測(cè)值基本符合。說(shuō)明響應(yīng)面法對(duì)金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化具有較強(qiáng)可靠性。因此，得到最佳培養(yǎng)基配方是：蔗糖20.07 g/L、酵母膏 20.04 g/L、MgSO4 0.70 g/L。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)Plackett-Burman試驗(yàn)確定了蔗糖、酵母膏、MgSO4為主要影響因素，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行最

陡爬坡試驗(yàn)，確定最佳響應(yīng)面區(qū)域，然后采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和Design Expert 軟件分析計(jì)算，得到這3種因素的添加量：蔗糖20.07 g/L、酵母膏20.04 g/L、MgSO4 0.70 g/L。經(jīng)過(guò)驗(yàn)

證在此發(fā)酵條件下金龜子綠僵菌生物量達(dá)到16.523 g/L，與原始發(fā)酵液的菌體生物量相比提高了37.24%，成本降低了約30%，有利于其工業(yè)化生產(chǎn)。然而此研究?jī)H限于搖瓶發(fā)酵，很多因素（如溶氧、通氣量等）難以有效控制，下一步可以上罐分批發(fā)酵，進(jìn)一步優(yōu)化影響金龜子綠僵菌發(fā)酵的條件。

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