王麗星　黃志偉　鄭亞鳳

摘要：研究了珍貴藥用菌——樟芝（Antrodia camphorata）液體發(fā)酵適宜的碳源、氮源、碳氮比及其所需的礦質(zhì)元素、微量元素、維生素。結(jié)果表明：樟芝菌絲生長的最適無機氮源為酒石酸銨；最適有機氮源為麩皮；最適天然碳源為米粉，且以天然多糖類物質(zhì)（木薯粉除外）為碳源處理的菌絲產(chǎn)量明顯高于單糖、雙糖、化學(xué)制劑多糖處理，而葡萄糖是僅次于天然多糖類物質(zhì)的碳源；菌絲生長適宜的碳氮比為（20～50） ∶ 1；K、P、Mg、S、Na、Ca均為菌絲生長必需的礦質(zhì)元素；微量元素Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co均對樟芝菌絲生長有一定抑制作用，其中Fe、B元素的抑制作用最顯著；添加維生素對菌絲生長無顯著影響。

關(guān)鍵詞：樟芝；菌絲體；液體發(fā)酵；培養(yǎng)基配方

中圖分類號： S188+.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）07-0236-03

樟芝（Antrodia camphorata）屬于多孔菌科、薄孔菌屬[1]，別稱牛樟菇、牛樟芝、樟內(nèi)菇、紅樟菰等，為中國臺灣特有的珍貴藥用真菌[2]。樟芝僅寄生在臺灣特有樹種牛樟（Cinnamomum comphora）的樹干上[3]，具有抗腫瘤、增加免疫力、抗菌、抗病毒、抗過敏、抗高血壓、降血糖、降膽固醇、抑制血小板凝集及保護肝臟等生理功能[4]。目前野生樟芝數(shù)量很少，而且尚未能進行其子實體的人工栽培，所以采用液體發(fā)酵培養(yǎng)樟芝的菌絲體是最環(huán)保的樟芝獲取途徑，并且菌絲體的效果接近子實體[5]。劉華等研究了樟芝液體發(fā)酵培養(yǎng)條件，采用的培養(yǎng)基配方為40 g/L葡萄糖、6 g/L豆餅粉、1 g/L K2HPO4、100 mg/L 維生素B1，pH值自然，接種量為20%，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，轉(zhuǎn)速100 r/min，26 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后，胞內(nèi)的三萜產(chǎn)量達 152.5 mg/L[6]。黃大斌等在電子顯微鏡下觀察了樟芝的菌絲體、子實體、分生孢子，并在瓊脂培養(yǎng)基上研究了不同碳源、氮源對樟芝菌絲生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樟芝菌絲生長最適溫度為28 ℃，木屑培養(yǎng)基的最適含水量為58.5%，最適碳源為2%葡萄糖，最適氮源為0.2%檸檬酸銨[7]。黃志偉等對樟芝菌絲體的固體培養(yǎng)特性進行了研究，結(jié)果表明以雜木屑、麥皮（或稻草粉）為主料的培養(yǎng)基均可培養(yǎng)出生長良好的樟芝菌絲，菌絲生長適宜的PDA 培養(yǎng)基pH 值為4～8，在木屑培養(yǎng)基中添加3%～5%的過磷酸鈣可促進菌絲生長，光照和黑暗條件下菌絲的生長速度沒有顯著差異，但在黑暗條件下菌絲長勢較好，分生孢子較多[8]。宋愛榮對樟芝液體培養(yǎng)的碳源、氮源分別進行了研究，結(jié)果表明碳源以麥芽糖利用效果最佳，有機氮比無機氮的利用效果更好，其中以酵母膏最佳[9-10]。陳娟等以樟芝菌絲生物量、三萜、多糖為響應(yīng)指標，利用Plackett-Burman法篩選樟芝液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源，結(jié)果顯示，最有利于提高樟芝菌絲生物量的碳源、氮源為葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉，最有利于提高樟芝多糖含量的碳源、氮源為可溶性淀粉、麩皮，而最有利于提高樟芝三萜含量的碳源為麥芽糖[11]。凌慶枝等研究表明，樟芝對不同無機鹽離子需求不同，對鉀鹽需求量大，對鈉鹽、鐵鹽、鎂鹽、銅鹽需求量少[12]。本研究探討了適宜樟芝液體發(fā)酵的碳源、氮源、碳氮比及其所需的礦質(zhì)元素和微量元素等，以期為深入研究樟芝的液體發(fā)酵工程技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 樟芝菌株Ac-A，由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基配方

1.1.2.1 研究不同氮源對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：3%葡萄糖、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L 維生素B1，pH值自然。添加的無機氮種類為硫酸銨、氯化銨、磷酸氫二銨、酒石酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣、硝酸銨；有機氮種類為蛋白胨、大豆粉、麩皮、玉米粉。氮源添加量為0.032 g N/100 mL無機氮、0.2%蛋白胨、5%天然有機氮。

1.1.2.2 研究不同碳源對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：0.032%（以氮含量計算）酒石酸銨、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L維生素B1、pH值自然。添加的碳源種類為葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、微晶纖維素、玉米粉、面粉、米粉、甘薯粉、木薯粉。碳源添加量為2%。

1.1.2.3 研究不同碳氮比對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：2%葡萄糖、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O、5 mg/L 維生素B1，pH值自然。分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的酒石酸銨以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的C/N。

1.1.2.4 研究不同礦質(zhì)元素對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸銨、5 mg/L 維生素B1，pH值自然。按表1在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加各種試劑，配制出6種缺素培養(yǎng)基和1種對照培養(yǎng)基。

1.1.2.5 研究不同微量元素對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸銨、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O，pH值自然，用重蒸餾水配制1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，加入15 g CaCO3，在121 ℃下滅菌20 min，冷卻后過濾除去微量元素，隨后加入5 mg 維生素B1，并按表2添加各種微量元素。

1.1.2.6 研究不同維生素對樟芝菌絲生長影響的培養(yǎng)基配方 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：2%葡萄糖、0.211%酒石酸銨、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O，pH值自然。添加的維生素種類為生物素、核黃素、硫胺素、尼古丁酸、葉酸、抗壞血酸，對照不添加任何維生素。維生素添加量為50 μg/L。

1.2 方法

1.2.1 不同氮源對樟芝菌絲生長的影響 將培養(yǎng)基分裝于250 mL三角瓶中（100 mL/瓶），每個處理4瓶，在121 ℃下滅菌30 min。接種時，先將樟芝斜面菌種放入盛有無菌水的三角瓶中，用分散器攪拌勻漿，使之成為均勻的菌液。然后用移液槍吸取菌液接種于各瓶培養(yǎng)基中（1 mL菌液/100 mL），接種后置于搖床上振蕩培養(yǎng)（26 ℃、120 r/min ）20 d。用紗布和40目土樣篩過濾樟芝菌絲，分別盛入已于105 ℃下烘至恒質(zhì)量的坩堝，再將坩堝置于105 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量后，測定菌絲干質(zhì)量。然后用SAS 軟件 對數(shù)據(jù)進行方差分析與顯著性測驗。

1.2.2 不同碳源、礦質(zhì)元素、微量元素、維生素對樟芝菌絲生長的影響 參照“1.2.1”節(jié)的方法進行培養(yǎng)基的分裝、滅菌、接種、培養(yǎng)、測定菌絲干質(zhì)量等。

1.2.3 不同碳氮比對樟芝菌絲生長的影響 設(shè)置8個C/N，即 5 ∶ 1、10 ∶ 1、15 ∶ 1、20 ∶ 1、30 ∶ 1、50 ∶ 1、75 ∶ 1、100 ∶ 1，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加酒石酸銨調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的C/N，酒石酸銨添加量依次為16.03、6.35、3.96、2.88、1.86、1.09、0.72、0.54 g/L。然后參照“1.2.1”節(jié)的方法進行培養(yǎng)基的分裝、滅菌、接種、培養(yǎng)、測定菌絲干質(zhì)量等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源對樟芝菌絲生長的影響

2.1.1 無機氮對樟芝菌絲生長的影響 由圖1可見，不同氮源處理下菌絲產(chǎn)量差異較大，說明樟芝對氮源種類的要求較為嚴格。不同氮源處理下樟芝菌絲產(chǎn)量高低排序為蛋白胨（有機氮）>銨態(tài)氮>硝態(tài)氮，差異明顯。以硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸鈣為氮源時，菌絲產(chǎn)量與對照無明顯差異，說明樟芝不能利用硝態(tài)氮。硝酸銨既可以提供硝態(tài)氮，也可提供銨態(tài)氮，其菌絲產(chǎn)量比硝態(tài)氮高，但比銨態(tài)氮低，說明NO-3可能抑制樟芝菌絲生長。樟芝菌絲生長最適宜的無機氮源為酒石酸銨。

2.1.2 有機氮對樟芝菌絲生長的影響 由圖2可見，不同有機氮源處理下樟芝菌絲產(chǎn)量高低順序為麩皮>大豆粉>玉米粉>蛋白胨>無氮對照，差異明顯。以麥皮為氮源時，其菌絲產(chǎn)量是蛋白胨處理的5倍，是最適于樟芝菌絲生長的氮源。

2.2 不同碳源對樟芝菌絲生長的影響

從圖3可以看出，以天然多糖類物質(zhì)為碳源處理的菌絲產(chǎn)量明顯高于雙糖、單糖。以米粉為碳源處理的菌絲產(chǎn)量最大，與其他碳源處理差異明顯。本研究使用了5種天然物質(zhì)和2種化學(xué)制劑多糖，除木薯粉外，以天然物質(zhì)為碳源處理的菌絲產(chǎn)量明顯高于以化學(xué)制劑多糖（可溶性淀粉、微晶纖維素）為碳源的處理。將天然物質(zhì)作為碳源，水解后可提供多

種糖類供菌絲吸收利用，并且它還含有少量氮素營養(yǎng)或一些生長促進因子，可促進菌絲生長。以麥芽糖、蔗糖為碳源處理的菌絲產(chǎn)量較低。葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇中，唯有葡萄糖適于樟芝菌絲生長。

2.3 不同碳氮比對樟芝菌絲生長的影響

基于上述碳源、氮源的篩選結(jié)果，選用適于樟芝菌絲生長的碳源（葡萄糖）和無機氮源（酒石酸銨）來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 C/N，以研究適宜樟芝菌絲生長的C/N。從圖4可以看出，在所研究的C/N范圍內(nèi)，C/N為10 ∶ 1以上時均適于樟芝菌絲生長，在C/N為（20～50） ∶ 1時菌絲生長最快。

2.4 不同礦質(zhì)元素對樟芝菌絲生長的影響

從圖5可以看出，礦質(zhì)元素K、P、Mg、S、Na、Ca的缺乏均會明顯影響樟芝菌絲的生長，即這6種元素均為菌絲生長必需的礦質(zhì)元素。其中，缺Na、缺Ca對菌絲產(chǎn)量影響較小，而K、P、Mg、S的缺乏將極大程度地影響菌絲生長。

2.5 不同微量元素對樟芝菌絲生長的影響

從圖6可以看出，7種微量元素（Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、

Co）均對樟芝菌絲生長有一定的抑制作用，其中Fe、B元素對樟芝菌絲生長的抑制作用最為明顯。

2.6 不同維生素對樟芝菌絲生長的影響

從圖7可以看出，所添加的6種維生素均對樟芝菌絲的生長沒有明顯影響。

3 結(jié)論與討論

本研究分析了樟芝液體發(fā)酵適宜的碳源、氮源、碳氮比及其所需的礦質(zhì)元素和微量元素等，結(jié)果表明樟芝菌絲生長的最適無機氮源為酒石酸銨，最適有機氮源為麩皮；最適天然碳源為米粉，且以天然多糖類物質(zhì)（木薯粉除外）為碳源處理的菌絲產(chǎn)量明顯高于單糖、雙糖、化學(xué)制劑多糖處理；菌絲生長適宜的碳氮比為（20～50） ∶ 1；K、P、Mg、S、Na、Ca均為菌絲生長必需的礦質(zhì)元素；微量元素Fe、B、Zn、Mn、Mo、Cu、Co均對樟芝菌絲生長有一定的抑制作用，其中Fe、B元素的抑制作用最顯著；添加維生素對菌絲生長無明顯影響。

本研究中以蛋白胨為氮源處理的菌絲產(chǎn)量明顯高于無機氮源處理。而黃大斌等研究發(fā)現(xiàn)，在瓊脂培養(yǎng)基上以蛋白胨、酵母汁為氮源處理的菌絲生長速度不如檸檬酸銨、硝酸銨、硫酸銨等無機氮源處理[7]。因此，如果用瓊脂培養(yǎng)基活化樟芝菌種，應(yīng)采用無機氮源；如果進行樟芝菌絲體的液體發(fā)酵生產(chǎn)，則應(yīng)采用有機氮源。

本研究表明，以葡萄糖為碳源處理的樟芝菌絲產(chǎn)量明顯高于麥芽糖、半乳糖處理，且葡萄糖是僅次于天然多糖類物質(zhì)的碳源。而黃大斌等研究表明，在瓊脂培養(yǎng)基上，以葡萄糖為碳源處理的菌絲生長速度快于山梨醇糖、半乳糖、麥芽糖、淀粉處理[7]。因此，以葡萄糖作為碳源，不但適于樟芝菌種的活化，而且適于樟芝菌絲體的液體發(fā)酵生產(chǎn)。

本研究還表明，在樟芝的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中不需要添加維生素。因此，可以推測在樟芝菌絲生長過程中，菌絲體會合成自身生長所需維生素。

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