陸守昆，楊青青，王紅菊，李金鳳，沈　羽，占新華

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

不同條件下小麥根系吸收菲的動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化

陸守昆，楊青青，王紅菊，李金鳳，沈羽，占新華*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095）

為揭示植物根系吸收多環(huán)芳烴（PAHs）的生物化學(xué)機(jī)制，建立疏水性有機(jī)污染物的植物根系吸收數(shù)學(xué)模型，并為科學(xué)預(yù)測(cè)農(nóng)作物的污染風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)，采用水培方法研究了不同溫度、pH、培養(yǎng)時(shí)間以及地上部分去除與否條件下小麥根系吸收菲的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在15～30℃范圍內(nèi)，小麥根系菲吸收的Km（米氏常數(shù)）、Vmax（最大吸收速率）隨著溫度的升高而增大，Km、Vmax與溫度的關(guān)系滿足指數(shù)函數(shù)關(guān)系；當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，Km和Vmax的值均出現(xiàn)了下降；在pH為3.00～8.00時(shí)，小麥根系對(duì)菲的親和力隨著pH的升高而降低，pH為5.50時(shí)Vmax達(dá)到最大值；幼苗期小麥根系對(duì)菲的親和力隨著苗齡的增加而增大，Vmax隨著苗齡的增加而減??；活體根和離體根的菲吸收動(dòng)力學(xué)差異不明顯。研究顯示，溫度、pH、苗齡均能顯著影響小麥根系菲吸收的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

吸收動(dòng)力學(xué)；菲；小麥；溫度；pH；苗齡

陸守昆，楊青青，王紅菊，等.不同條件下小麥根系吸收菲的動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（9）：1660-1664.

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多環(huán)芳烴類化合物（PAHs）是環(huán)境中普遍存在的持久性有毒有機(jī)污染物，具有強(qiáng)烈的“三致”效應(yīng)［1］，美國(guó)EPA優(yōu)先控制污染物名單中包含了16種PAHs［2］。PAHs的強(qiáng)疏水性和難降解性使其在土壤環(huán)境中大量累積，進(jìn)而污染農(nóng)作物，危害人類健康。因此植物對(duì)土壤中PAHs的吸收及其機(jī)制研究已受到研究者的廣泛關(guān)注。

植物對(duì)有機(jī)物的吸收是一個(gè)復(fù)雜的主動(dòng)、被動(dòng)或主被動(dòng)兼有的過(guò)程［3］。近年來(lái)，不少研究者基于被動(dòng)吸收的假設(shè)建立了一些有機(jī)污染物的吸收模型［4-6］。由于未考慮主動(dòng)吸收過(guò)程，在運(yùn)用這些模型預(yù)測(cè)植物對(duì)包含主動(dòng)過(guò)程的有機(jī)污染物的吸收時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大偏差，而且不能圓滿地解釋不同環(huán)境條件下根系吸收有機(jī)污染物能力的差異。主動(dòng)過(guò)程相較于被動(dòng)過(guò)程更易于調(diào)控且更易受到環(huán)境因素的影響，吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)則可以揭示并表征主動(dòng)吸收過(guò)程，因而吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究對(duì)根系吸收數(shù)學(xué)模型的建立就顯得尤為重要。早在20世紀(jì)50年代，Epstein和Hagen就將酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程應(yīng)用于植物對(duì)離子的吸收中。Caassen等［7］依據(jù)動(dòng)力學(xué)方程構(gòu)建了養(yǎng)分離子的吸收模型，方程中最大吸收速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）兩個(gè)參數(shù)可定量描述植物根系吸收養(yǎng)分離子的特征，能表征環(huán)境條件對(duì)植物吸收養(yǎng)分的影響。盡管目前對(duì)植物根系吸收PAHs的機(jī)理與動(dòng)力學(xué)特征方面已開(kāi)展了大量研究［8-10］，但是關(guān)于不同環(huán)境條件對(duì)植物根系吸收PAHs的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。自然界中植物的生長(zhǎng)環(huán)境千差萬(wàn)別，不同溫度及pH等條件下植物根系活力及吸收能力會(huì)發(fā)生變化，植物根系吸收PAHs的動(dòng)力學(xué)特征也必然會(huì)發(fā)生改變。探討環(huán)境條件對(duì)植物根系吸收PAHs動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響有助于深入揭示植物根系吸收PAHs的生物化學(xué)機(jī)制和科學(xué)預(yù)測(cè)農(nóng)作物PAHs污染的風(fēng)險(xiǎn)。

為此，本文選取小麥為材料，菲為PAHs的代表，通過(guò)水培試驗(yàn)，探究不同條件下植物根系吸收PAHs的動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異，旨在揭示植物根系吸收PAHs的動(dòng)力學(xué)參數(shù)在不同環(huán)境條件下的變化規(guī)律，為闡釋植物根系吸收PAHs的生物學(xué)機(jī)制及構(gòu)建作物根系吸收PAHs的機(jī)制型數(shù)學(xué)模型，更準(zhǔn)確有效地預(yù)測(cè)農(nóng)作物PAHs污染的風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試小麥（Triticum aestivum L.）品種為南農(nóng)9918（江蘇地區(qū)主要栽培品種之一），購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種子站。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1幼苗培養(yǎng)

選取一定量比較均一的小麥種子用去離子水浮選去除癟粒，然后用3%H2O2消毒5 min。消毒洗凈后的小麥種子置于底部鋪有用去離子水浸濕的濾紙的搪瓷托盤中，并放入恒溫培養(yǎng)箱中，在黑暗、25℃條件下進(jìn)行催芽。種子出芽后轉(zhuǎn)移至底部鋪有石英砂的搪瓷托盤中，并放入人工氣候箱，白天/夜晚溫度分別為25℃/20℃，光照強(qiáng)度為400 μmol·s-1·m-2，光周期為16 h，相對(duì)空氣濕度為75%的條件下培養(yǎng)7 d。1.2.2水培試驗(yàn)

選擇長(zhǎng)勢(shì)比較一致的小麥幼苗移入水培箱內(nèi)進(jìn)行連續(xù)曝氣培養(yǎng)，先后在1/2濃度和全濃度Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（pH 5.50）中各培養(yǎng)3 d。接著用去離子水培養(yǎng)1 d，然后按以下方案進(jìn)行處理：①營(yíng)養(yǎng)液中ρ（菲）為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1，pH 5.50，分別在15、20、25、30、35℃條件下處理4 h；②營(yíng)養(yǎng)液中ρ（菲）梯度同①，25℃，在pH分別為3.00、5.50、8.00的條件下處理4 h；③營(yíng)養(yǎng)液中ρ（菲）梯度同①，pH 5.50，25℃，分別用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)7、10、14 d（即苗齡分別為14、17、21 d）的小麥幼苗處理4 h；④營(yíng)養(yǎng)液中ρ（菲）梯度同①，pH 5.50，25℃，分別用活體根和離體根處理4 h。以上方案中每個(gè)處理都在黑色蠟紙包裹的500 mL玻璃燒杯中進(jìn)行，各燒杯均加入500 mL營(yíng)養(yǎng)液，以PVC孔板固定小麥21株，然后置于人工氣候箱中曝氣培養(yǎng)，每處理設(shè)置3次重復(fù)。營(yíng)養(yǎng)液中菲用甲醇溶解后加入，且各處理均含有等量的甲醇（控制甲醇濃度小于0.1%，在此濃度范圍內(nèi)甲醇對(duì)小麥生長(zhǎng)無(wú)明顯影響［11］）。方案④中的離體根是從莖基部剪下的完整根。上述處理結(jié)束后，小麥根系用超純水洗凈后，放入甲醇中浸泡1～2 min，然后再用純水洗凈，擦干水分后測(cè)定菲含量。

1.2.3測(cè)定方法

稱取鮮重1.00 g左右小麥根或莖葉，剪碎混勻，裝入離心試管中，加入10 mL丙酮/二氯甲烷為1∶1（體積比）的混合溶液，超聲萃取30 min，萃取過(guò)程重復(fù)3次。將萃取液過(guò)無(wú)水硫酸鈉硅膠柱收集至50 mL錐形瓶中，然后用10 mL正己烷/二氯甲烷為1∶1（體積比）的混合溶液淋洗，合并收集液與洗脫液在40℃下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干；再用2 mL甲醇（色譜純）溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后用HPLC分析。同時(shí)在鮮樣中加入菲標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定回收率，該方法菲回收率為90.67%。

HPLC分析條件：美國(guó)Thermo公司UltiMate 3000 HPLC，泵的型號(hào)為L(zhǎng)PG-3400SDN，紫外檢測(cè)器型號(hào)為VWD-3100，色譜柱為4.6 mm×150 mm C18柱（Thermo，美國(guó)），柱溫30℃，流動(dòng)相為甲醇/水（80/20，V/V），流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與討論

2.1不同溫度條件下小麥根系菲吸收的動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化

溫度是影響酶和載體活性的重要因素［12-13］。通常，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶和載體的活性增強(qiáng)，植物根系載體的轉(zhuǎn)運(yùn)能力也會(huì)增強(qiáng)；超過(guò)最適溫度后，溫度的升高會(huì)抑制載體活性和體內(nèi)代謝，從而降低植物根系載體的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。溫度對(duì)小麥根系菲吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響如表1所示。在30℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高，小麥根系菲吸收動(dòng)力學(xué)的米氏常數(shù)和最大吸收速率均逐漸增大；當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí)，米氏常數(shù)和最大吸收速率開(kāi)始下降。在養(yǎng)分離子吸收動(dòng)力學(xué)的研究中［14-15］，Km為吸收速率達(dá)到最大吸收速率一半時(shí)營(yíng)養(yǎng)液中離子濃度，通常以1/Km表示載體親和力的大小，表征吸收效率的高低；Vmax是吸收所能達(dá)到的最大速率，其值越大，表明吸收的內(nèi)在潛力越大。Vmax較大，Km較小時(shí)有利于植物對(duì)養(yǎng)分的吸收［16］。轉(zhuǎn)運(yùn)載體親和力與溫度的關(guān)系因植物和底物而異，如紫萍H2PO-4轉(zhuǎn)運(yùn)載體親和力大小依次為25℃＞10℃＞35℃［17］；蘋果幼苗鐵離子載體親和力大小則依次為35℃＞25℃＞10℃［18］。本研究中，小麥菲轉(zhuǎn)運(yùn)載體親和力大小為15℃＞25℃＞30℃，表明小麥在相對(duì)低溫的條件下對(duì)菲的吸收效率較高。在本研究條件下，35℃范圍內(nèi)營(yíng)養(yǎng)液中菲濃度無(wú)明顯變化（P＜0.05）［19］，因此高溫小麥根系菲親和力差異不是因菲揮發(fā)引起的?？赡茉蚴牵悍妻D(zhuǎn)運(yùn)載體不同于紫萍磷酸根轉(zhuǎn)運(yùn)載體和蘋果苗鐵離子載體，其適宜溫度范圍較低。35℃小麥根系菲親和力增大可能是因介質(zhì)溫度過(guò)高導(dǎo)致小麥根系細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，從而削弱了細(xì)胞膜對(duì)菲吸收的屏障作用所致。

表1　不同溫度條件下小麥根系菲吸收的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for phenanthrene uptake by wheat roots at different temperatures

土壤溫度通常在25℃范圍內(nèi)［20］，因此對(duì)表1中30℃范圍內(nèi)Km、Vmax與溫度T（K）之間的關(guān)系采用指數(shù)方程擬合如下（擬合過(guò)程中開(kāi)氏溫度T=273.15+攝氏溫度t）：

據(jù)以上公式可以推算出某溫度下小麥根系菲吸收的Km和Vmax值。

2.2不同pH條件下小麥根系菲吸收的動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化

筆者課題組前期研究已證實(shí)需要載體協(xié)助并有耗能的主動(dòng)過(guò)程參與了根系PAHs的吸收，且此過(guò)程通過(guò)與H+共運(yùn)方式進(jìn)行［21］；小麥根系菲吸收會(huì)改變根系細(xì)胞內(nèi)部和外部的pH［22］，同時(shí)該吸收過(guò)程對(duì)營(yíng)養(yǎng)液中ρ（H+）具有依賴性，營(yíng)養(yǎng)液pH越高，根系菲的吸收量越小［21］。因此，介質(zhì)ρ（H+）的高低必然會(huì)對(duì)小麥根系菲吸收的動(dòng)力學(xué)過(guò)程產(chǎn)生影響。

在一定pH范圍內(nèi)，隨著pH升高，小麥根系菲吸收速率明顯減?。≒＜0.05，成對(duì)數(shù)據(jù)t-檢驗(yàn)，圖1），米氏常數(shù)值變大（表2），根系菲轉(zhuǎn)運(yùn)載體的親和力變小，小麥根系菲吸收的效率降低。研究發(fā)現(xiàn)在低pH的條件下，玉米根系A(chǔ)TPase酶活性、H+泵的活性、質(zhì)膜H+的滲透性都會(huì)增加［23］。而在低pH的條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)液中ρ（H+）較大，H+的勢(shì)能更高，H+進(jìn)入根系的速率也加快，進(jìn)而促進(jìn)了菲與H+共運(yùn)進(jìn)入小麥根系，導(dǎo)致在相同ρ（菲）下根系菲吸收的速率增加。在pH3.00時(shí)，菲轉(zhuǎn)運(yùn)載體親和力最大；在pH 5.50時(shí)，最大吸收速率的值最大。因此，弱酸條件更有利于小麥根系對(duì)菲的吸收。

2.3不同苗齡小麥根系菲吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化

在養(yǎng)分離子的吸收動(dòng)力學(xué)研究中，即使同一個(gè)植物品種，不同苗齡的根系對(duì)離子的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)也各異［24］。研究表明，培養(yǎng)6、13、20 d和27 d的蘋果幼苗對(duì)N、P、K、Ca、Mg、Mn、Zn、Fe元素的吸收速率明顯不同［25］。小麥幼苗隨苗齡的增長(zhǎng)對(duì)P、K的吸收下降，Vmax值變小而Km值增大［25］。小麥幼苗根系對(duì)菲的吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)隨著苗齡的增加也表現(xiàn)出差異（表3）。在三周內(nèi)，米氏常數(shù)和最大吸收速率都有減小的趨勢(shì)，但苗齡從14 d到17 d其吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化較17～21 d更為明顯，17 d之后動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化幅度變小。親和力的變化表明，隨著苗齡的增長(zhǎng)，小麥根系菲吸收效率增加。更長(zhǎng)時(shí)間小麥根系菲吸收能力的變化情況還有待進(jìn)一步的研究。隨著小麥的生長(zhǎng)，小麥根長(zhǎng)、根重、根尖數(shù)等形態(tài)參數(shù)都會(huì)發(fā)生變化［26-27］。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)根的形態(tài)在植物獲取土壤營(yíng)養(yǎng)元素的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［28］。Zhan等［29］逐步多元線性回歸分析結(jié)果表明，比表面積在小麥根系菲吸收過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。因此，筆者推測(cè)小麥生長(zhǎng)過(guò)程中根系形態(tài)的變化是導(dǎo)致小麥根系菲吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)發(fā)生變化的重要原因。

2.4小麥離體根和活體根菲吸收的動(dòng)力學(xué)比較

離體根是指剪掉植物的地上部分而保留莖基部以下的完整根。剪切對(duì)植株最直接的影響是降低了根系對(duì)水分的運(yùn)輸以及限制根系碳水化合物的供應(yīng)，其對(duì)養(yǎng)分離子吸收的抑制不僅通過(guò)阻斷蒸騰流中養(yǎng)分離子的被動(dòng)吸收過(guò)程，而且離子主動(dòng)向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)也被中斷。對(duì)離體根的研究，有助于闡明植物地上部分對(duì)根系吸收的影響以及有利于深入揭示有機(jī)污染在植物體內(nèi)遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理。在養(yǎng)分離子吸收動(dòng)力學(xué)研究中，離體根與活體根吸收動(dòng)力學(xué)是否一致尚無(wú)定論。有研究發(fā)現(xiàn)小麥離體根對(duì)養(yǎng)分和氣體的吸收都出現(xiàn)了下降［30］；韓振海等［14］研究表明，小金海棠、八楞海棠、青海花葉和山定子蘋果的離體根和活體根對(duì)Fe3+吸收的動(dòng)力學(xué)曲線基本一致。小麥離體根與活體根菲吸收的動(dòng)力學(xué)曲線如圖2所示。成對(duì)數(shù)據(jù)t-檢驗(yàn)表明，在0～1.0 mg·L-1ρ（菲）內(nèi)離體根與活體根菲吸收的動(dòng)力學(xué)無(wú)顯著差異（P＞0.05），即地上部在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)小麥根系菲吸收動(dòng)力學(xué)的影響不明顯，植物根系有機(jī)污染物吸收動(dòng)力學(xué)更大程度上依賴植物根系在特定環(huán)境條件下自身的吸收能力。

圖1　不同pH條件下小麥根系菲吸收速率的濃度依賴性Figure 1 Concentration-dependent uptake of phenanthrene by wheat roots at different pH values

表2　不同pH條件下小麥根系菲吸收的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters for phenanthrene uptake by wheat roots at different pH values

表3　不同苗齡小麥根系菲吸收的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetic parameters for phenanthrene uptake by wheat roots at different seedling ages

圖2　小麥活體根和離體根菲吸收速率的濃度依賴性Figure 2 Concentration-dependent uptake of phenanthrene by in vivo and in vitro wheat roots

3　結(jié)論

（1）在15～30℃范圍內(nèi)，小麥根系菲的最大吸收速率和米氏常數(shù)隨著溫度的升高而增大，其與溫度的關(guān)系滿足指數(shù)方程，通過(guò)此方程可以推算出該溫度范圍內(nèi)任意溫度下小麥根系菲吸收的Km和Vmax值。

（2）在pH 3.00～8.00范圍內(nèi)，小麥根系菲吸收的速率隨著pH的增加而降低。在pH 3.00～5.50條件下，小麥根系對(duì)菲的親和力強(qiáng)、吸收潛力大，表明弱酸條件更有利于小麥根系菲吸收。在實(shí)際生產(chǎn)中可以通過(guò)調(diào)控土壤pH，以減少農(nóng)作物對(duì)菲的吸收。

（3）水培條件下，幼苗期小麥隨著苗齡的增加，小麥根系對(duì)菲親和力增強(qiáng)。更長(zhǎng)生育期小麥根系菲吸收動(dòng)力學(xué)變化情況還有待進(jìn)一步的研究。

（4）水培4 h內(nèi)，小麥離體根與活體根吸收菲的動(dòng)力學(xué)無(wú)顯著差異。

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Changes in kinetic parameters of phenanthrene uptake by wheat roots under different conditions

LU Shou-kun，YANG Qing-qing，WANG Hong-ju，LI Jin-feng，SHEN Yu，ZHAN Xin-hua*
（College of Resources and Environmental Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）are ubiquitous contaminants in the environment.Dietary intake of plant-based foods has become a major contribution to the total exposure of PAHs for the human beings.Because of well-documented carcinogenicity，mutagenicity and toxicity of PAHs to humans，it is of great importance to establish a model of PAH uptake by crop roots for health risk assessments of human exposure to PAHs.However，little information is available regarding such models of PAH uptake by crop roots including active transport.Here hydroponic experiments were employed to investigate the kinetic parameters of phenanthrene uptake by wheat roots under different temperatures，pHs，and wheat seedling ages.In a temperature range of 15～30℃，Kmand Vmaxincreased with an increase in temperature.The relationship between Kmor Vmaxand temperature was well fitted with an exponential function.When the temperature was higher than 35℃，Kmand Vmaxdecreased.At pH of 3.00～8.00，the affinity of phenanthrene to wheat root carrier proteins decreased with increasing pH.The Vmaxwas greatest at pH 5.50.However，the affinity of phenanthrene to wheat root carriers increased with seedling growth，but Vmaxwas just reverse.There was no significant difference in uptake kinetics between in vivo and in vitro wheat roots.Therefore，it was concluded that temperature，pH and seedling age have remarkable effects on kinetic parameters of phenanthrene uptake by wheat roots.Our results provide insights into both biochemical mechanisms underlying PAH uptake by plant roots and data for establishing model for PAH uptake by crop roots.

uptake kinetics；phenanthrene；wheat；temperature；pH；seedling age

S512.1

A

1672-2043（2016）09-1660-05doi：10.11654/jaes.2016-0255

2016－03－01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370521）

陸守昆（1990—），男，江蘇淮安人，碩士研究生，從事疏水性有機(jī)污染物模型構(gòu)建研究。E-mail：15150533892@163.com

占新華E-mail：xhzhan@njau.edu.cn