達(dá)洛嘉 馬家麟 白雪等

摘要[目的]研究藏藥鋪散亞菊揮發(fā)油的主要成分及其抑菌活性。 [方法]采用超臨界CO2法萃取鋪散亞菊揮發(fā)油成分，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）結(jié)合相對保留指數(shù)進(jìn)行組分分析鑒定，并通過濾紙片擴(kuò)散法篩選鋪散亞菊揮發(fā)油對常見13種致病菌的抑菌活性。 [結(jié)果]從鋪散亞菊超臨界CO2萃取物中共分離出127個(gè)可識別峰，含量高于0.02%的化學(xué)成分為46種，占總萃取物的67.30%。鋪散亞菊揮發(fā)油對乙型副傷寒沙門菌、產(chǎn)氣腸桿菌等11種供試菌表現(xiàn)出抑菌活性。 [結(jié)論] GC-MS結(jié)合保留指數(shù)對鋪散亞菊超臨界CO2萃取揮發(fā)油進(jìn)行定性分析，使定性結(jié)果更為可靠。該研究結(jié)果可為鋪散亞菊揮發(fā)油的抗菌活性研究提供試驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞鋪散亞菊；超臨界CO2 萃?。籊C-MS；抑菌活性

中圖分類號R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2016）04-004-04

Study on the Chemical Constituents and Antibacterial Activity of the Volatile Oil from Ajania khartensis by Supercritical CO2 Fluid Extraction

DA Luojia，MA Jialin，BAI Xue，LIN Pengcheng* et al （Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai Province，Key Laboratory of Plant Resources of QinghaiTibet Plateau in Chemical Research，College of Pharmacy，Qinghai University for Nationalities，Xining，Qinghai 810007）

Abstract[Objective] To research the chemical components of volatile oil from Ajania khartensis，and to investigate their antimicrobial activities. [Method] The volatile oil from Ajania khartensis was obtained by supercritical CO2 fluid extraction，then combined GCMS analysis with retention index to appraise the chemical components，and screened antimicrobial activities of the volatile to thirteen common bacterial pathogens by filter paper diffusion method. [Result] 127 identifiable peaks were isolated from the volatile oil，among them，46 components′ relative content were higher than 0.02% which accounted for 67.30% of the total extract. The volatile oil from Ajania khartensis showed some antimicrobial activities against Salmonella paratyphy B and Enterobacter aerogenes. [Conclusion] It ensures the qualitative results by using GCMS and retention index to analyze the chemical components of volatile oil from Ajania khartensis.The filter paper diffusion method provides a reliable preparatory screening result for antimicrobial activities of volatile oil from Ajania khartensis.

Key wordsAjania khartensis； Supercritical CO2 fluid extraction； GCMS； Antibacterial activity

鋪散亞菊（Ajania khartensis），為菊科亞菊屬多年生鋪散草本，分布在印度、俄羅斯以及我國青海、云南、寧夏、西藏、四川、甘肅等地區(qū)，生長于海拔2 500～5 300 m的地區(qū)，一般生長于向陽山坡[1]，具有濃郁的特征氣味。鋪散亞菊在藏藥典籍《晶珠本草》中記載為蒿阿仲，主要用于治療肺熱癥[2]。張興旺等[3]通過水蒸餾法提取鋪散亞菊揮發(fā)油并使用GCMS進(jìn)行分析鑒定，但使用超臨界CO2 提取鋪散亞菊揮發(fā)油及后續(xù)抑菌活性的研究則鮮見報(bào)道。筆者采用超臨界CO2 通用條件對鋪散亞菊揮發(fā)油進(jìn)行萃取[4]，獲得揮發(fā)油使用GCMS分離鑒定，結(jié)合相對保留指數(shù)進(jìn)行更準(zhǔn)確地定性[5]。致病微生物所引起的肺部感染屬于中醫(yī)肺熱證范疇[6]。筆者用鋪散亞菊治療肺熱，采用濾紙片擴(kuò)散法[7-8]研究其揮發(fā)油對13種常見致病菌的抑菌效果，以佐證其在藏藥中的功效。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。13株供試菌株購自中國藥品生物制品檢定所，具體見表1。

1.1.2藥材。藏藥鋪散亞菊于2014年8月采自青海省互助北山林場，經(jīng)青海民族大學(xué)藥學(xué)院毛繼祖教授鑒定為藏藥鋪散亞菊。

1.1.3試劑與耗材。CO2為醫(yī)用級（北京市華元?dú)怏w化工有限公司）；正構(gòu)烷烴混合對照品（C7～C30），購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司；營養(yǎng)瓊脂，購自北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；蛋白胨，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；丙酮，購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司。所用試劑都為分析純。耗材有濾紙片等（d=6 mm）。

1.1.4儀器。氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，型號為7890A/5975C，為美國Agilent公司產(chǎn)品； G1888頂空進(jìn)樣器，為Agilent公司產(chǎn)品；四極桿質(zhì)譜檢測器；質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫：NIST08 MS search 2.0；色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（MSD Chemstation D.03.00.611），為美國Agilent公司產(chǎn)品；超臨界CO2萃取儀，型號為7071（SFE-2），購自美國ASI公司；空壓機(jī)；SDC6冷循環(huán)水系統(tǒng)；HZQX100A型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；AS1060L型高壓滅菌鍋，為鄺杏生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；SWCJ2FD型超潔凈工作臺(tái)，為蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1超臨界CO2萃取物的制備。將鋪散亞菊全草粉碎后過60目篩，稱取200 g投入1 L萃取釜中，加熱萃取釜溫度至50 ℃穩(wěn)定，泵入CO2壓力設(shè)定為25 MPa，靜態(tài)萃取1.5 h，出樣口溫度100 ℃。

1.2.2鋪散亞菊萃取物的GC-MS保留指數(shù)分析。

1.2.2.1樣品制備。取0.01 g鋪散亞菊萃取物，加到2 mL丙酮中充分溶解。

1.2.2.2色譜條件。色譜柱為HP5彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為He 氣，柱流量為0.8 mL/min。用于手動(dòng)進(jìn)樣的程序升溫條件為：初始溫度60 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2.3質(zhì)譜條件。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜調(diào)諧；電離方式EI，電子能量70 eV；四級桿溫度：150 ℃；離子源溫度：230 ℃；輔助區(qū)溫度：295 ℃；溶劑延遲時(shí)間：3 min；數(shù)據(jù)采集掃描模式：全掃描。質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍（m/z）50～550。

1.2.2.4保留指數(shù)（KI）的測定。手動(dòng)進(jìn)樣針精密移取正構(gòu)烷烴混合對照品5 μL，按照“1.2.2.3”下的條件直接進(jìn)樣，經(jīng)程序升溫后得到條件分析的結(jié)果，用于組分KI 值的計(jì)算；記錄該條件下C7～C30各正烷烴的保留時(shí)間，采用線性升溫公式KI=100n +100（tx-tn）/（ tn+1- tn）計(jì)算各組分的KI 值，其中tx、tn和tn+1分別為被分析組分流出峰的保留時(shí)間和被分析組分保留時(shí)間相鄰的碳原子數(shù)處于n 和n+1 之間的正烷烴（tn

1.2.3鋪散亞菊揮發(fā)油的抑菌活性測定。

1.2.3.1菌種活化。①接種乙型溶血性鏈球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、藤黃微球菌等11種細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)18～24 h。②接種白色念球菌和黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)3～5 d。

1.2.3.2菌懸液的制備。①將上述細(xì)菌培養(yǎng)物加入無菌0.9%氯化鈉溶液配制成濃度為108 CFU/mL的菌懸液；②將上述真菌培養(yǎng)物加入3 mL無菌的0.9%氯化鈉溶液（含0.05%（V/V）吐溫80），混勻后將溶液表面的孢子緩慢吸出至無菌試管內(nèi)，并配制成濃度為108 CFU/mL的孢子懸液。

1.2.3.3含菌平板的制備及最低抑菌濃度（MIC）的測定。采用濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法，對鋪散亞菊揮發(fā)油的抑菌圈直徑進(jìn)行測定。用移液槍吸取已制備好的待試菌株菌懸液0.2 mL，加入200 mL的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或馬丁氏培養(yǎng)基中，混合均勻。將帶有菌懸液的培養(yǎng)基依次倒入培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固。配制不同濃度（2.00、1.00、0.50和0.25 mg/mL）的揮發(fā)油。用移液槍分別吸取4種不同濃度的揮發(fā)油溶液，加至濾紙片上，待濾紙片完全潤透，用已滅菌的鑷子將浸有揮發(fā)油溶液的濾紙片貼在待試菌培養(yǎng)基上，用丙酮或0.9%氯化鈉溶液（含0.05%（V/V）吐溫80）溶液作為空白對照。每個(gè)濃度進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。將含菌平板置于培養(yǎng)箱中，將細(xì)菌在30 ℃下培養(yǎng)18～24 h，真菌25 ℃條件下培養(yǎng)24～48 h后測量抑菌圈直徑。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h后，每1 h對平板進(jìn)行觀察，以抑菌圈最大直徑為最終記錄值。

2結(jié)果與分析

2.1超臨界CO2萃取物所得萃取物為黃色固體，具有濃郁的香氣。

2.2鋪散亞菊萃取物的GC-MS保留指數(shù)分析以峰面積歸一化法計(jì)算萃取物各組分相對含量，選擇峰面積大于0.02%、NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫匹配度高于90以上的組分共46個(gè)，并計(jì)算各峰與標(biāo)準(zhǔn)譜庫匹配度前3位的組分保留指數(shù)，與NIST數(shù)據(jù)庫中保留指數(shù)進(jìn)行比較，以質(zhì)譜和保留指數(shù)匹配度最接近的物質(zhì)為最優(yōu)結(jié)果。由表2可知，從鋪散亞菊超臨界CO2萃取物中共分離出127個(gè)可識別峰，按照以上條件鑒定出46種組分，占總萃取物的67.30%。

2.3最低抑菌濃度（MIC）平板產(chǎn)生抑菌效果時(shí)的揮發(fā)油最低濃度即為最低抑菌濃度。由表3可知，鋪散亞菊揮發(fā)油對11種致病菌具有抑菌活性。其中，乙型副傷寒沙門菌、產(chǎn)氣腸桿菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌的MIC值為0.50 mg/mL；金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌、乙型溶血性鏈球菌、白色念球菌的MIC值為1.00 mg/mL；蠟樣芽胞桿菌、銅綠假單胞菌的MIC值為2.00 mg/mL。

3結(jié)論與討論

筆者通過超臨界CO2所萃取的鋪散亞菊揮發(fā)油，外觀上為黃色固體，具有濃烈的特異性氣味，區(qū)別于常規(guī)水蒸汽蒸餾法提取的揮發(fā)油，這是由于超臨界CO2 所萃取組分為小極性，含較多的脂肪族類化合物，此類物質(zhì)常溫下大多為固體，在揮發(fā)油中占據(jù)主要成分，因此通過超臨界CO2 萃取的藏藥鋪散亞菊揮發(fā)油常溫下為固態(tài)。在收集萃取物時(shí)應(yīng)將出樣口溫度保持在100 ℃，以防止樣品中所含水分在出樣口結(jié)冰堵住管路，出樣時(shí)氣體流速不能過快，流速過快會(huì)使揮發(fā)油得率下降，尤其是低沸點(diǎn)組分容易流失。超臨界CO2萃取法具有提取得率高、沒有有機(jī)溶劑殘留、操作溫度低、萃取物純度高等優(yōu)點(diǎn)，非常適合于高效率制備植物揮發(fā)油成分[9]。

GC-MS結(jié)合相對保留指數(shù)對鋪散亞菊揮發(fā)油進(jìn)行分析鑒定，能夠使鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確。從鋪散亞菊超臨界CO2萃取物中共分離出127個(gè)可識別峰，其中峰面積大于0.02%，NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫匹配度高于90以上的組分46個(gè)，占總萃取物的67.30%，其中以脂肪酸類、烴類、醇類、酯類為主要成分。脂肪酸中亞麻油酸含量高達(dá)20.15%，具有調(diào)節(jié)血脂作用、預(yù)防心肌梗塞和腦梗塞、抗炎等作用[10-11]。

筆者通過濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法對鋪散亞菊揮發(fā)油進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對乙型副傷寒沙門菌、產(chǎn)氣腸桿菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌、乙型溶血性鏈球菌、白色念球菌、蠟樣芽胞桿菌、銅綠假單胞菌11種供試菌具有抑菌作用，且對其中的乙型副傷寒沙門菌、產(chǎn)氣腸桿菌、藤黃微球菌、肺炎克雷伯菌4種菌具有較好的抑菌作用。鋪散亞菊揮發(fā)油濃度與抑菌效果成正比，鋪散亞菊揮發(fā)油濃度越高，抑菌效果越好，而且無論是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌，均有著明顯的抑菌活性，說明鋪散亞菊揮發(fā)油有廣譜、高效的抗菌活性。該試驗(yàn)結(jié)果可為今后對鋪散亞菊揮發(fā)油在抑菌方面的開發(fā)提供有效的試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國科學(xué)院植物志編輯委員會(huì).中國植物志：第76（1）[M].北京：科學(xué)出版社，1999：46.

[2] 帝瑪爾·丹增彭措.晶珠本草[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2012： 193.

[3] 張興旺，朱鵬程，梅麗娟，等.鋪散亞菊揮發(fā)油化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010（B08）：36-38.

[4] 楊必成，楊義芳.超臨界流體萃取中藥及天然產(chǎn)物的樣品制備和預(yù)處理方法研究進(jìn)展[J].中草藥，2010，41（8）：391-394.

[5] 梁晟，李雅文，趙晨曦，等.GCMS結(jié)合保留指數(shù)對中藥揮發(fā)油的定性[J].分析測試學(xué)報(bào)，2008，27（1）：84-87.

[6] 盧紅蓉.清燥救肺湯治療肺熱證（肺部感染）的文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

[7] 羅建軍，曾涌，陳衛(wèi)瓊，等.亞菊屬植物化學(xué)成分和藥理活性研究進(jìn)展[J].中藥材，2014，37（12）：2304-2311.

[8] 黃賽金，尹愛武，羅紫英，等.高良姜揮發(fā)油抑菌及抗氧化作用研究[J].食品工業(yè)科技，2015（19）：112-115.

[9] 高艷霞，蘇延友，賈鳳娟，等.超臨CO2流體萃取及GCMS聯(lián)用技術(shù)優(yōu)化提取和分析四葉參揮發(fā)油成分[J].中國新藥雜志，2015（14）：1665-1669.

[10] 張春娥，張惠，劉楚怡，等.亞油酸的研究進(jìn)展[J].糧油加工，2010（5）：18-21.

[11] 趙敏.亞油酸及亞油酸甲酯的抗炎作用研究[D].成都：西南交通大學(xué)，2012.