文　瑤，周　瑋，劉　棗，王永澤*，王金華

（湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

中和劑對(duì)大腸桿菌工程菌HBUT-L16發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的影響

文瑤，周瑋，劉棗，王永澤*，王金華

（湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

該文對(duì)前期構(gòu)建的產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸的大腸桿菌工程菌HBUT-L進(jìn)行了耐乳酸鈉的馴化，并對(duì)馴化前后菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的中和劑進(jìn)行了選擇和對(duì)比。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)28代馴化后的菌株HBUT-L16以Ca（OH）2作中和劑時(shí)發(fā)酵效果較NaOH為中和劑時(shí)效果好，L-乳酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了6.6%、5.6%、44.4%。與馴化前菌株HBUT-L的發(fā)酵結(jié)果相比，HBUT-L16以Ca（OH）2為中和劑進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，乳酸產(chǎn)量提高了4.4%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了2.8%，生產(chǎn)強(qiáng)度增加了26.71%；而以NaOH為中和劑時(shí)，對(duì)馴化前后菌株的發(fā)酵效果影響不大，由此推測(cè)耐乳酸鈉的馴化主要通過(guò)提高工程菌對(duì)乳酸根的耐受性而非鈉離子的耐受性，來(lái)提高L-乳酸的產(chǎn)量。

大腸桿菌工程菌；L-乳酸；馴化；中和劑

目前，L-乳酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)，而且L-乳酸作為生物降解材料聚乳酸的單體越來(lái)越受到人們的重視，極具應(yīng)用前景。大腸桿菌（Escherichiacoli）具有遺傳背景清楚、易于進(jìn)行基因工程改造、發(fā)酵周期較短和營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)，在L-乳酸生產(chǎn)中扮演了重要角色［1-2］。

前期已構(gòu)建成功一批大腸桿菌工程菌用于L-乳酸的發(fā)酵，并研究了不同中和劑對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響［3-5］。在此基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步通過(guò)耐乳酸鹽的馴化，提高菌株對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的耐受性，達(dá)到提高發(fā)酵乳酸的產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度的目的。但高濃度乳酸鹽除了乳酸根以外，還存在陽(yáng)離子，因此在馴化大腸桿菌其耐受性時(shí)，到底是提高了菌株耐乳酸根的能力，還是提升了菌株耐陽(yáng)離子的能力不容易判斷。這個(gè)問(wèn)題關(guān)系到乳酸發(fā)酵中和劑的選擇，這是因?yàn)樵谌樗岚l(fā)酵過(guò)程中，不同中和劑會(huì)帶來(lái)一些不同濃度的離子而影響發(fā)酵。如以氨水作為中和劑時(shí)，發(fā)酵液中NH4+濃度積累到一定程度，就開(kāi)始抑制菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)酸的能力［6］。研究表明，以Ca（OH）2為中和劑時(shí)，Ca2+的存在對(duì)菌體的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用［7］，以NaOH作中和劑，會(huì)帶來(lái)一定濃度的鈉離子［8］。如能判斷出馴化后菌株對(duì)離子的耐受性，無(wú)疑對(duì)中和劑的選擇有較大的幫助。

本研究擬對(duì)大腸桿菌工程菌HBUT-L進(jìn)行了耐乳酸鈉的馴化后，再對(duì)馴化前后菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的中和劑進(jìn)行了選擇和對(duì)比，以期了解乳酸鈉馴化對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸時(shí)中和劑的選擇帶來(lái)影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

實(shí)驗(yàn)菌株大腸桿菌（Escherchia coli）HBUT-L，為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏于-80℃冰箱。以D-乳酸工程菌HBUT-D為出發(fā)菌株［9］，敲除其D-乳酸脫氫酶基因，同時(shí)插入帶有自身啟動(dòng)子序列的L-乳酸脫氫酶基因，具有良好的L-乳酸發(fā)酵特性［10］。

1.1.2培養(yǎng)基

乳酸鈉馴化培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)［11］配制NBS培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加0～14%的乳酸鈉和20 g/L的葡萄糖。發(fā)酵種子培養(yǎng)基：含有20 g/L葡萄糖的NBS培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：150 mL NBS培養(yǎng)基，40 g/L碳酸鈣，70 g/L葡萄糖。

發(fā)酵培養(yǎng)基：3 L NBS培養(yǎng)基，100 g/L葡萄糖。

1.1.3主要試劑

蛋白胨（生化試劑）：上海盛思生化科技有限公司；酵母粉（生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；氯化鈉、碳酸鈣、乳酸鈉、Ca（OH）2、NaOH（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖（分析純）：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；瓊脂（生化試劑）：上海拜力生物科技有限公司；D-乳酸鈉和L-乳酸鈉（色譜級(jí)）：美國(guó)SIGMA-ALORICH公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.2儀器與設(shè)備

7 L發(fā)酵罐：德國(guó)貝朗醫(yī)療有限公司；SBA-40D生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；e2695高效液相色譜：美國(guó)Waters公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1HBUT-L的適應(yīng)性馴化及搖瓶驗(yàn)證

挑取活化好的平板單菌落4～6個(gè)接種至150 mL含有2%乳酸鈉的馴化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)代培養(yǎng)，每代測(cè)菌體生物量（OD600nm），當(dāng)連續(xù)數(shù)代OD600nm值變化較小時(shí)，按2%的接種量轉(zhuǎn)接至150 mL含4%乳酸鈉的新鮮馴化培養(yǎng)基中，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，依此類(lèi)推，逐漸將乳酸鈉含量提高至12%，并在此濃度條件下反復(fù)馴化培養(yǎng)直至OD600nm值趨于平穩(wěn)，對(duì)馴化后的菌株命名為HBUT-L16。

分別對(duì)HBUT-L和HBUT-L16進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。挑取LB平板上活化好的單菌落4～6個(gè)，接種至含有150 mL新鮮NBS培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37℃、200 r/min培養(yǎng)7～8 h后，獲得種子液。按2%的接種量接種至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為：37℃，200 r/min。定時(shí)取樣，檢測(cè)樣品中菌體生物量（OD600nm值）、殘留葡萄糖濃度、L-乳酸含量及其光學(xué)純度。

1.3.2中和劑對(duì)HBUT-L發(fā)酵效果的影響

分別對(duì)馴化前的菌株和馴化后的菌株在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。挑取LB平板上活化好的單菌落4～6個(gè)，接種至含有300mL新鮮NBS培養(yǎng)基的1L錐形瓶中，37℃、200 r/min培養(yǎng)7～8 h后，獲得種子液。發(fā)酵罐中初始裝液體積為3 L，接種量為10%。發(fā)酵條件為：37℃，200 r/min，中和劑分別采用3 mol/L Ca（OH）2和6 mol/L NaOH，通過(guò)自動(dòng)流加中和劑的方式控制發(fā)酵液pH在7.0左右。定時(shí)取樣，檢測(cè)樣品中菌體生物量（OD600nm值）、殘留葡萄糖濃度、L-乳酸含量。

1.3.3測(cè)定方法

樣品中菌體生物量（OD600nm值）、殘留葡萄糖濃度、L-乳酸含量參照文獻(xiàn)［10-11］的方法進(jìn)行；發(fā)酵液中有機(jī)酸副產(chǎn)物乙酸、琥珀酸的測(cè)定按照參考文獻(xiàn)［9-10］的方法進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1HBUT-L在乳酸鈉中適應(yīng)性馴化的結(jié)果

為了提高HBUT-L在較高濃度乳酸鹽條件下的生長(zhǎng)能力，采用一定濃度梯度的乳酸鈉對(duì)其進(jìn)行了長(zhǎng)期的適應(yīng)性馴化，馴化后的菌株命名為HBUT-L16。

表1　大腸桿菌HBUT-L在乳酸鹽中的適應(yīng)性馴化結(jié)果Table 1 Adaptive domestication results ofE.coliHBUT-L in lactate

本研究在對(duì)菌株HBUT-L進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，逐漸提高乳酸鈉的含量，來(lái)緩解乳酸根對(duì)大腸桿菌HBUT-L菌體生長(zhǎng)的抑制。從表1的結(jié)果可知，馴化28代后的菌株HBUT-L16在12%乳酸鹽含量條件下培養(yǎng)所得OD600nm值為0.48，與馴化前OD值相比有較大的降低。但與一些在乳酸根濃度在10%以上就停止生長(zhǎng)的菌株［13］相比，經(jīng)過(guò)28代馴化得到的菌株HBUT-L16具有較好的生長(zhǎng)特性。

為了驗(yàn)證乳酸鈉對(duì)HBUT-L的馴化效果，對(duì)馴化前后的菌株在搖瓶中的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，經(jīng)過(guò)馴化，殘?zhí)怯神Z化前的10.23 g/L降低至3.34 g/L，乳酸產(chǎn)量提高了15.29%。

表2　馴化前后搖瓶發(fā)酵效果的比較Table 2 Results of fermentation in shake flask before and after domestication

2.2馴化前菌株在不同中和劑中的發(fā)酵效果

為了研究馴化前菌株在不同中和劑中的發(fā)酵效果，試驗(yàn)中分別采用3mol/LCa（OH）2和6mol/LNaOH作為中和劑對(duì)菌株HBUT-L進(jìn)行發(fā)酵研究，發(fā)酵結(jié)果分別如圖1、圖2所示。

圖1　菌株HBUT-L以Ca（OH）2為中和劑發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Fermentation kinetic curve of strain HBUT-L using Ca（OH）2as neutralizer

從圖1可以看出，以Ca（OH）2為中和劑進(jìn)行L-乳酸發(fā)酵時(shí)，在發(fā)酵初期0～12 h，菌體以生長(zhǎng)為主，12 h以后菌體生長(zhǎng)迅速，發(fā)酵到24 h，菌體生長(zhǎng)趨于緩慢；從糖耗來(lái)看，發(fā)酵初期0～12h，葡萄糖消耗較為緩慢，12 h后發(fā)酵液中葡萄糖含量急劇下降，34 h后未檢測(cè)到殘?zhí)?；與生長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)，發(fā)酵到12 h，L-乳酸合成速率加快，發(fā)酵至32 h，乳酸產(chǎn)量為94.05 g/L。

圖2　菌株HBUT-L以NaOH為中和劑發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Fermentation kinetic curve of strain HBUT-L using NaOH as neutralizer

從圖2可以看出，菌株HBUT-L以NaOH為中和劑發(fā)酵乳酸時(shí)，發(fā)酵初期0～4 h，菌體生長(zhǎng)緩慢，4 h以后菌體快速生長(zhǎng)，發(fā)酵到24 h，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期；發(fā)酵4 h后葡萄糖消耗速率明顯加快，24 h后葡萄糖消耗速率開(kāi)始減慢，38 h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，殘留葡萄糖僅為0.23 g/L；與菌體生長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)，L-乳酸的產(chǎn)量在發(fā)酵4 h后就快速增加，發(fā)酵24 h后產(chǎn)量增加幅度變緩，乳酸最終產(chǎn)量為91.72 g/L。

2.3馴化后菌株在不同中和劑中發(fā)酵效果

為了研究馴化后菌株在不同中和劑的發(fā)酵效果，試驗(yàn)中分別采用3 mol/L Ca（OH）2和6 mol/L NaOH為中和劑對(duì)HBUT-L16進(jìn)行發(fā)酵研究，發(fā)酵結(jié)果分別如圖3、圖4所示。

圖3　菌株HBUT-L16以Ca（OH）2為中和劑發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Fermentation kinetic curve of strain HBUT-L16 using Ca（OH）2as neutralizer

從圖3可以看出，菌株HBUT-L16以Ca（OH）2為中和劑進(jìn)行L-乳酸發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵初期0～12 h，菌體生長(zhǎng)較為緩慢，12h以后菌體生長(zhǎng)迅速，發(fā)酵到24h，菌又體生長(zhǎng)趨于緩慢；糖耗和菌體生長(zhǎng)的趨勢(shì)基本相關(guān)，發(fā)酵12 h后葡萄糖消耗急劇增加，發(fā)酵到28 h，已檢測(cè)不到發(fā)酵液中的殘?zhí)牵籐-乳酸的合成也和菌體的生長(zhǎng)同步，12 h以后乳酸產(chǎn)量增長(zhǎng)迅速，28 h達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，乳酸產(chǎn)量98.23 g/L。

圖4　菌株HBUT-L16以NaOH為中和劑發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Fermentation kinetic curve of strain HBUT-L16 using NaOH as neutralizer

由圖4可以看出，菌株HBUT-L16以NaOH為中和劑發(fā)酵乳酸時(shí)，發(fā)酵到8h，菌體就進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，發(fā)酵到24 h，菌體生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)；葡萄糖消耗在前8 h也較為緩慢，8 h后消耗開(kāi)始快速增加；同樣，乳酸生成與菌體生長(zhǎng)存在相關(guān)性，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后（8 h后）乳酸產(chǎn)量不斷增加，一直發(fā)酵到38 h，加堿停止，發(fā)酵結(jié)束，殘?zhí)菫?.23 g/L，乳酸產(chǎn)量達(dá)到92.19 g/L。

2.4乳酸鈉馴化對(duì)中和劑選擇的影響

為了研究乳酸鈉馴化對(duì)中和劑選擇的影響，對(duì)馴化前后菌株利用不同中和劑的發(fā)酵結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比。

表3　菌株HBUT-L和菌株HBUT-L16利用不同中和劑發(fā)酵效果的比較Table 3 Fermentation comparison between strains HBUT-L and HBUT-L16 with different neutralizers

由表3可知，馴化前菌株HBUT-L或馴化后的菌株HBUT-L16在以Ca（OH）2作中和劑時(shí)，L-乳酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度等指標(biāo)均比NaOH作中和劑時(shí)要高。HBUT-L16以Ca（OH）2為中和劑時(shí)，L-乳酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度分別為98.23 g/L、98.66%和3.51 g/（L·h），比以NaOH作為中和劑的發(fā)酵結(jié)果相比，分別提高了6.6%、5.6%、44.4%。

究其原因，可能在于以下兩點(diǎn)：首先，以Ca（OH）2作為中和劑時(shí)，能為菌體生長(zhǎng)提供Ca2+，使菌體快速進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，縮短發(fā)酵周期，因而能獲得較大的生產(chǎn)強(qiáng)度［3.51g/（L/h）］。而以NaOH作為中和劑時(shí)，發(fā)酵罐中OD600nm值達(dá)到4.67，菌體密度相對(duì)較低，發(fā)酵周期延長(zhǎng)了10 h，大大影響了乳酸的生產(chǎn)強(qiáng)度。其次，從理論進(jìn)行分析，1分子的Ca（OH）2可以中和2分子的乳酸，而1分子的NaOH只能中和1分子的乳酸。因此，Ca（OH）2相對(duì)NaOH來(lái)說(shuō)具有更強(qiáng)的中和能力，生產(chǎn)相同量的L-乳酸，中和劑Ca（OH）2的用量相對(duì)較少，那么發(fā)酵液中的滲透壓小，更適合菌體的生長(zhǎng)和發(fā)酵。

由表3還可知，馴化后的菌株，在以Ca（OH）2作中和劑時(shí)，相比馴化前的菌株，乳酸產(chǎn)量提高了4.4%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了2.8%，生產(chǎn)強(qiáng)度增加了26.71%；而以NaOH為中和劑進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，馴化前后菌株的發(fā)酵結(jié)果相差不大。這可能是由于以NaOH作為中和劑進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，生成的鈉鹽均能完全溶解，導(dǎo)致發(fā)酵液中滲透壓偏高，因此發(fā)酵液中高濃度可溶物質(zhì)（如鈉鹽）的存在對(duì)發(fā)酵有不利影響［14-15］，菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵都比較緩慢。雖然通過(guò)乳酸鈉的馴化，馴化后菌株產(chǎn)L-乳酸能力未見(jiàn)大的提升，可能原因是馴化后菌株鈉離子耐受性仍未提高。而馴化后菌株以Ca（OH）2為中和劑進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，與馴化前相比表現(xiàn)出較好的發(fā)酵性能。因此，采用乳酸鈉對(duì)菌體進(jìn)行長(zhǎng)期馴化，主要是提高了菌體對(duì)乳酸根的耐受性。

3　結(jié)論

菌株HBUT-L經(jīng)過(guò)28代馴化，搖瓶中乳酸產(chǎn)量提高了15.29%。不論是馴化前的菌株HBUT-L還是馴化后的菌株HBUT-L16，以Ca（OH）2作中和劑時(shí)，L-乳酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)強(qiáng)度等指標(biāo)均比氫氧化鈉作中和劑時(shí)要高。菌株HBUT-L16以Ca（OH）2為中和劑時(shí)，乳酸產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別提高了6.6%、5.6%、44.4%。

與馴化前菌株HBUT-L的發(fā)酵結(jié)果相比，菌株HBUT-L16以Ca（OH）2為中和劑進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，乳酸產(chǎn)量提高了4.4%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了2.8%，生產(chǎn)強(qiáng)度增加了26.71%；而以NaOH為中和劑時(shí)，對(duì)馴化前后菌株的發(fā)酵效果影響不大。結(jié)果表明，采用乳酸鈉對(duì)菌體進(jìn)行長(zhǎng)期馴化，主要是提高了菌體對(duì)乳酸根的耐受性。

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Effects of neutralizers on L-lactic acid yield byEscherichia coliHBUT-L16 fermentation

WEN Yao，ZHOU Wei，LIU Zao，WANG Yongze*，WANG Jinhua
（Hubei Cooperative Innovation Center for Industrial Fermentation，Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

A previously engineeredEscherichia coliwith high yield of optical purity L-lactic acid was domesticated to resist sodium lactate，and neutralizer that evolved in strain fermentation for L-lactic acid production before and after domestication was selected and compared.Results showed that the strain HBUT-L16 which was adaptively evolved for 28 generation had a better fermentation effect with Ca（OH）2as neutralizer comparing with that of NaOH as neutralizer，the L-lactic acid yield，sugar-acid conversion rate and productivity increased 6.6%，5.6%and 44.4%，respectively.Comparing with the results of undomesticated strain HBUT-L，the strain HBUT-L16 produced 4.4%more L-lactic acid，2.8%more conversion rate and 26.71%more productivity in the fermentation with Ca（OH）2as neutralizer.While there was no obvious influence on the results using NaOH as neutralizer.So it suggested that the L-lactic acid yield was improved mainly by improving the tolerance of engineered strain for lactate but not for Na+.

engineeredEscherichia coli；L-lactic acid；domestication；neutralizer

Q815

0254-5071（2016）09-0043-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.010

2016-04-16

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.2011CDB076）；湖北省教育廳項(xiàng)目（No.B20121402）；國(guó)家級(jí)本科教學(xué)質(zhì)量與教學(xué)改革工程項(xiàng)目（No.201210500032）

文瑤（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

王永澤（1976-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能利用與酶工程。